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申嗪霉素是假单胞菌产生的一种重要次级代谢产物,其有效化学成分为吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid,简称PCA）,能防治多种植物病害,如水稻纹枯病、小麦全蚀病和南瓜枯萎病等,与传统农药相比其具有高效、低毒、环境友好等特点。由于化学法合成吩嗪-1-羧酸不仅产率低而且会产生大量有毒有害副产物,目前主要通过微生物发酵的方法大规模生产申嗪霉素。但现有工程菌株申嗪霉素发酵效价偏低,导致其生产成本和用药成本偏高,严重阻碍了其大范围的推广应用。因此,有必要对PCA生物合成的调控机理展开基础理论研究,并基于此通过遗传代谢改造提高其合成效率,从而进一步促进申嗪霉素在实际生产中的推广应用。假单胞菌PA1201是水稻根际分离的生防菌株,因高产PCA和吩嗪-1-酰胺（phenazine-1-carboxamide,PCN）而著称,其申嗪霉素的产量是M18菌株的3-4倍,是高产申嗪霉素工程菌株的新型微生物资源。在铜绿假单胞菌PAO1中,QslA作为一种小蛋白调控因子,负调控次级代谢产物绿脓菌素（5-N-methylphenazine,PYO）的生物合成;而其在PA1201菌株中对PCA生物合成的调控机制至今还没有展开相应的研究。通过生物信息学的比对分析发现:qsl A在铜绿假单胞菌大家族中是高度保守的,相似性均在99%以上;但是根据其两边的基因组成差异可将铜绿假单胞菌分为以PAO1、M18、RP73为代表的三种不同类型。qsl A报告系统β-半乳糖苷酶酶活分析显示:QslA在生长早期几乎不参与调控自身基因的表达,但从对数期开始正调控自身基因的表达。本实验以PA1201为研究对象,通过同源重组无痕敲除技术构建qsl A缺失突变株,HPLC检测分析发现:与野生型相比,qsl A突变体中PCA的产量升高,同时过表达该基因又显著降低PCA的产量,说明在PA1201中QslA负调控PCA的生物合成。通过β-半乳糖苷酶酶活分析显示:该负调控作用主要由phz1基因簇参与完成;进一步分析发现此调控过程与phz1基因簇启动子的5’-UTR（56bp）区域息息相关。同时通过遗传学的方法证实:在PA1201菌株中,QslA对PCA生物合成的负调控是不依赖于Las R以及Rhl R这两大群体感应系统的。经LC-MS检测菌体内群体感应信号分子的产量发现:QslA负调控PQS和HHQ这两类群体感应信号分子的生物合成,但不影响3-oxo-C12-HSL和C4-HSL信号分子的产量;遗传学的分析也显示:QslA借助于Pqs R负调控PCA的生物合成。酵母双杂实验证实QslA与Pqs R具有蛋白互作,同时通过基于结构域的片段截断实验分析证实:Pqs R蛋白的CBD（complex binding domain）结构域是与QslA蛋白互作所必须的。异源表达并纯化QslA和Pqs RMBP融合蛋白,经体外CD光谱分析表明:蛋白混合液的CD光谱图在222 nm,218 nm和208 nm波长处吸收峰发生变化,也进一步证实QslA与Pqs R间的蛋白互作。同时体内的Ch IP-PCR实验也显示:Pqs R与phz1基因簇的启动子区域结合,调控该基因簇的表达,而QslA抑制二者的结合。综合上述实验结果可知:在PA1201菌株中,QslA通过与Pqs R蛋白的互作,调控PQS和HHQ信号分子的合成,进而影响Pqs R与phz1基因簇上游启动子区域的5’-UTR结合,最终实现负调控PCA的生物合成。MvaU是H-NS家族的成员,它不仅作为结构蛋白参与细菌染色质的组装,还能利用碱基序列AT含量的差异识别获取的外源基因并沉默其表达。本研究发现:在PA1201菌株中敲除mva U,能够明显提高PCA的产量;而过表达mva U,PCA产量又显著下降。利用构建的phz基因簇转录融合报告系统、群体感应信号分子检测、EMSA及RNA-Seq分析等方法对MvaU的调控机制进行深入探究。半乳糖苷酶酶活分析显示:敲除mva U并不影响phz1基因簇的表达,却显著提高phz2基因簇的表达,说明phz2基因簇在MvaU调控PCA生物合成过程中起关键作用。进一步通过截短phz2基因簇启动子区域构建的酶活报告系统几乎确定了MvaU蛋白与启动子区域结合的大致碱基序列位置:-35 box附近（110 bp）;进一步通过EMSA和Ch IP-PCR实验分析证实MvaU蛋白能够与phz2基因簇的启动子直接结合。MvaU蛋白也能与自身基因的启动子区域结合,从而随着生长时期的变化调控自身基因的表达,进而使得MvaU调控的下游目标基因的表达也随生长周期而变化。同时RNA-seq分析显示:在PA1201菌株中,MvaU参与调控606个基因的表达,其中负调控的基因有366个,正调控的为240个,负调控的基因明显多于正调控的基因,该结果与MvaU主要负责沉默基因表达的生物学功能是一致的。其调控的基因参与菌体的多种生理过程,说明MvaU不仅参与细菌体内遗传物质的组装,同时也参与调控十分复杂的生理过程,推测MvaU可能还通过间接的方式调控PCA的生物合成。据此,我们勾勒出了MvaU调控PCA生物合成的模式图:MvaU直接与phz2基因簇启动子中的AT-rich区域结合,然后调控phz2基因簇的表达,最终抑制PCA的生物合成。综上所述,我们详细阐明了在铜绿假单胞菌PA1201中,调控因子QslA及H-NS家族蛋白MvaU负调控PCA生物合成的分子机理,为下一步遗传代谢改造构建PCA的高产工程菌株提供了理论依据,是申嗪霉素的商业化推广和大范围应用的前期铺垫。