骨髓间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓中的非造血干细胞，来自中胚层，Jiang和Veffoillie证明其具有多向分化能力，不仅能分化成中胚层的脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉、血管内皮等，还能跨胚层分化为内胚层的肝细胞、肺泡上皮细胞和外胚层的神经细胞。MSC注射到新生小鼠脑中，能够在前脑和小脑中迁移并且分化为神经胶质细胞和神经元。由于MSC的多向分化潜能，在很多非造血组织的自我更新能力，及其应用于细胞与基因治疗的可能性，使得其受到了越来越多的关注。　　 MSC不表达主要组织相容性复合体MHCⅡ分子、CD40、CD80、CD86等共刺激分子，不表达或极低水平表达MHCⅠ分子，MSC不易被宿主T细胞识别，并能逃脱宿主免疫系统的排斥，因此认为MSC具有低免疫原性;MSC在不同的微环境中，能分泌一些生长因子，如脑源性神经生长因子(BDNF)，肝细胞生长因子(HGF)，神经生长因子(NGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等，同时还分泌白介素如IL-7，IL-6，IL-8，IL-11，IL-12，巨噬细胞集落刺激因子，干细胞因子等，这些因子是海马神经前体细胞存活，生长和分化所需要的。MSC具有向受损部位迁移的趋势（归巢效应）;MSC是成体组织干细胞，其可以从自体取得，而且在体外容易分离、扩增，不涉及伦理学问题。综上所述，MSC是一个理想的细胞及基因治疗的载体。目前很多学者已经将MSC应用于脑外疾病动物模型，取得了显著的效果。如:糖尿病，肾损伤，肝损伤，克罗恩病，骨折，脊柱损伤，成骨不全症，关节炎，心肌梗死等。　　 神经系统与其他组织不同，在神经组织中存在血脑屏障，是脑和循环系统之间的一个代谢和生理性屏障结构，血脑屏障的功能在于阻止循环中的药物、毒素等外源物质入脑以保护中枢神经系统免受损害。目前很多学者将MSC通过外科的手段直接注射到诸如阿尔茨海默病动物模型的脑室中，发现MSC可以分化成神经胶质细胞和神经元，并且能够分泌一些营养因子，从而缓解AD的症状，但是这种通过外科手段直接脑内注射MSC，易引起脑水肿，危险性大。静脉移植MSC比较安全，但是由于血脑屏障的存在，移植效率很低，因此要想取得理想的治疗效果就必须克服血脑屏障这个难关。目前MSC穿过血脑屏障的机制还不清楚，所以我们希望在本课题中阐明MSC穿过血脑屏障的机制，并在此基础上人工干预使其高效通过血脑屏障，为中枢神经系统疾病的治疗提供新方法。　　 方法：　　 一、探讨MSC穿过血脑屏障体外模型所涉及的信号通路及机制　　 （一）MSCs的分离培养和鉴定　　 1、在无菌条件下取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞体外分离、培养和扩增　　 2、免疫细胞化学染色法鉴定MSCs表面标志CD45和CD90的表达情况　　 3、免疫荧光染色检测MSCs作用于HBMECs单层引起HBMECs紧密连接蛋白ZO-1的变化　　 （二）免疫荧光染色检测MSCs作用于HBMECs单层引起HBMECs的紧密连接蛋白ZO-1的变化　　 （三）Phalloidin染色方法检测MSCs作用于HBMECs单层引起HBMECs的F-actin的变化　　 （四）MSC跨内皮迁移试验　　 1、 MSC穿过血脑屏障体外模型的建立　　 2、利用(己)建立的模型研究PKC，PI3K/Akt，Rho/ROCK信号通路对MSC穿过HBMECs的能力的影响　　 （五）Phalloidin染色方法检测PKC，PI3K/Akt，Rho/ROCK信号通路对MSC的F-actin的影响　　 （六）利用Transwell检测Rho/ROCK通路对MSC迁移的影响　　 （七）Western Blotting法检测MSC与HBMEC作用后引起HBMEC紧密连接蛋白Occludin的变化　　 （八）腺病毒表达载体的构建　　 1、Pshuttle-Ires-hrGFP-2-△P85/△P110穿梭质粒的构建　　 2、带有siROCK穿梭子(pshuttle)的构建　　 3、腺病毒重组　　 4、病毒包装　　 5、Ad-△P85，Ad-ROCK RNAi，Ad-△P110病毒颗粒感染MSC　　 (1) Ad-△P85，Ad-△P110病毒颗粒感染MSC，并检测重组质粒的表达　　 (2) Ad-ROCK RNAi病毒颗粒感染MSC，并验证有效的干扰序列　　 (3)病毒感染的MSC穿过体外血脑屏障模型实验　　 二、ROCK基因knock-down修饰的MSC穿过Aβ沉积大鼠体内血脑屏障的能力升高及其机制　　 （一）细胞培养　　 （二）Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染MSC　　 （三）海马内Aβ沉积大鼠模型的制备　　 （四）Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染MSC尾静脉移植到Aβ沉积大鼠模型体内　　 （五）冰冻切片检测Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染的MSC穿过血脑屏障的情况　　 （六）基因芯片检测Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染MSC表达谱的变化　　 （七）Real-time PCR体外验证差异基因的表达　　 （八）基于基因芯片结果分析干扰MSC中的ROCK基因能提高其在大鼠模型体内穿过血脑屏障能力的机制　　 结果：　　 一、大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定　　 取大鼠的股骨，利用贴壁法培养骨髓间充质干细胞(MSC)，分离纯化的MSC呈梭形，在培养皿中呈现规律的漩涡状排列，符合MSC的形态特征;免疫细胞化学的方法检测结果显示分离的细胞CD90阳性，CD45阴性，符合MSC的特征，提示MSC分离成功。　　 二、MSC与脑微血管内皮细胞相互作用　　 MSCs能够引起HBMECs的紧密连接的开放，骨架胞骨架蛋白F-actin的解聚，将MSC与HBMEC共培养，免疫荧光发现MSC与HBMEC共培养后HBMEC的紧密连接蛋白ZO-1的完整性被破坏，随着作用时间的延续，ZO-1的完整性破坏越严重。同时F-actin也随着作用时间的延长解聚。　　 三、MSC穿过体外血脑屏障模型的过程涉及PI3K/ROCK信号分子　　 1、MSC穿过体外血脑屏障模型的建立　　 2、用信号通路的抑制剂处理MSC，筛选参与MSC穿过HBMEC单层的信号分子　　 用PKC/PI3K/ROCK信号通路的抑制剂分别处理MSC，利用体外血脑屏障的模型，寻找影响MSC穿过脑内皮单层的信号分子，结果显示PI3K/ROCK信号分子参与了MSC跨脑内皮迁移的过程，抑制MSC胞内PI3K信号分子，抑制MSC穿过HBMEC，抑制MSC胞内ROCK信号分子，促进MSC穿过HBMEC单层。　　 3、抑制MSCs的Rho/ROCK通路能够引起其细胞形态学的改变以及F-actin的解聚。　　 用y27632抑制MSC中的Rho瓜OCK通路，MSC的形态发生了变化，失去了细胞极性，伸出较多且长的伪足，其骨架蛋白F-actin也发生了解聚，变短，甚至呈点状，无规律的散布于胞浆内。　　 4、抑制MSCs的Rho/ROCK通路能够促进MSCs的迁移　　 用y27632抑制MSC中的Rho/ROCK通路，利用血脑屏障的体外模型，观察其穿过的情况，结果发现与正常MSC相比，y27632处理的MSC穿过HBMEC的数目明显多于对照组，提示抑制MSC胞内的Rho瓜OCK能够促进MSCs的HBMEC迁移。　　 5、抑制MSCs的Rho/ROCK通路能够促进MSCs在穿过HBMECs单层过程中引起HBMECs紧密连接的开放　　 y27632处理MSC，然后与HBMEC共培养6h，免疫荧光法检测HBMEC中膜旁蛋白ZO-1的变化，结果显示y27632处理过的MSC作用于HBMEC单层引起的ZO-1的断裂情况较未处理的MSC更加严重。　　 y27632处理MSC，然后与HBMEC共培养6h，提取HBMEC的蛋白质，Western blot检测紧密连接蛋白occludin的变化，结果显示y27632处理过的MSC与未处理的MSC相比，明显使HBMEC中的不可溶性occludin与可溶性occludin的比值明显降低，提示y27632处理MSC能使紧密连接破坏的更严重。　　 四、腺病毒介导的MSC中PI3K/ROCK信号通路的抑制，对MSC穿过HBMEC单层的影响　　 1、成功构建腺病毒表达载体Ad-△P85/△P110/ROCK RNAi　　 利用PCR的方法扩增△P85/△P110片段，并通过公司合成ROCK RNAi的片段，通过限制性内切酶定向克隆到相应的穿梭载体中，酶切，测序鉴定构建成功。用电转的方法使穿梭载体与腺病毒的骨架载体重组，通过酶切鉴定重组子，命名为Ad-△P85/△P110/ROCK RNAi。　　 2、Ad-△P85/△P110/ROCK RNAi腺病毒载体的包装　　 提取Ad-△P85/△P110/ROCK RNAi质粒，用pacⅠ线性化后，转染AD293细胞，以绿色荧光蛋白作为标记观察，成功获得一级病毒颗粒，二级病毒颗粒，三级病毒颗粒。　　 3、Ad-△P85，Ad-ROCK RNAi，Ad-△P110病毒颗粒感染MSC，在荧光微镜下观察，感染率能达到70％以上　　 (1) Western blot检测Ad-△P85，Ad-△P110重组体在MSC中成功表达　　 (2) Western blot检测到四个干扰序列中sh-1能使MSC中的ROCK蛋白表达下降　　 4、Ad-△P85/△P110/ROCK RNAi病毒感染的MSC穿过体外血脑屏障模型实验　　 用Ad-△P85/△P110/ROCK RNAi病毒颗粒分别感染MSC，利用血脑屏障的体外模型研经过修饰的细胞穿过HBMEC的情况，结果发现同对照组MSC相比，Ad-△P85/△P110感染的MSC穿过HBMEC的数目明显降低;与Ad-nonsilence感染的MSC相比，Ad-ROCK RNAi感染的MSC穿过HBMEC的数目明显增多。提示抑制MSC胞内的PI3K信号通路能抑制MSC穿过HBMEC单层，而抑制MSC胞内的Rho/ROCK信号通路则能促进MSC穿过HBMEC单层。　　 五、抑制MSC中的ROCK分子促进其穿过Aβ沉积大鼠体内血脑屏障　　 1、海马Aβ沉积大鼠模型的制备　　 将大鼠用10％的水合氯醛麻醉后，利用立体定位仪，将预先纤维化的Aβ1-42注射到大鼠双侧海马中，成功构建Aβ沉积大鼠模型。　　 2、Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染MSC　　 准备处于对数生长期的MSC，根据病毒滴度，用Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染MSC，48h后荧光显微镜下观察，感染率在70％以上。　　 3、Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染的MSC经尾静脉移植　　 将Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染的MSC消化计数，按照1×106/ml/只大鼠的剂量，经尾静脉注射到Aβ沉积大鼠体内。　　 4、Ad-ROCK RNAi感染的MSC穿过血脑屏障的数目明显增高　　 MSC移植3天后，将大鼠灌流，冰冻切片，隔10取1，DAPI染镜下观察MSC穿过的情况，结果显示Ad-ROCK RNAi感染的MSC穿血脑屏障的数目明显高于Ad-nonsilence感染的MSC穿过的数目，结果提示抑制MSC胞内的Rho/ROCK通路能增加MSC穿过血脑屏障的能力。　　 六、分析MSC穿过血脑屏障的机制　　 1、基因芯片检测Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染MSC表达谱的变化　　 用Ad-ROCK RNAi与Ad-nonsilence病毒颗粒感染第三代长势良好MSC，收集细胞，送基因公司做芯片，检查两种细胞表达谱的变化。结果检出180个差异基因，其中与细胞迁移，粘附，吞噬有关的基因共13个，包括Thbd1、MMP9、MMP12、 CD16、 CXCL11、CXCL12、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、LCP1、Aif1、Ceacam10。　　 2、Real-time PCR体外验证差异基因的表达情况　　 设计Real-time PCR引物，用相对定量的方法体外验证差异基因的表达与芯片结果一致，即在Ad-ROCK RNAi感染的MSC中Thbd1、MMP9、MMP12、CD16、CXCL11、CXCL12、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、LCP1、Aif1及Ceacam10等基因表达增高。　　 基于基因芯片结果分析干扰MSC中的ROCK基因促进其穿过体外血脑屏障模型及Aβ沉积大鼠模型血脑屏障可能与Thbd1、MMP9、MMP12、CD16、CXCL11、CXCL12、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、LCP1、Aif1及Ceacam10等基因的表达增高有关。　　 3、RT-PCR检测人脑微血管内皮细胞中相关受体的表达　　 根据芯片结果，查找与CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CXCL11、CXCL12相互作用的因子，设计RT-PCR引物，检测这些目标受体基因在HBMEC中的表达情况结果显示目标受体CCR1、CCR2、CCR3、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7及CX3CR1在HBMEC上均有表达。因此MSC跨HBMEC的迁移可能与配体-受体的相互作用有关。　　 4、Aβ能促进HBMECs中的受体表达增加　　 用Aβ刺激HBMEC、CCR1、CCR2、CCR3、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7及CX3CR1的表达具有时间依赖性和浓度依赖性，125nMAβ刺激HBMEC2h，这些受体的表达增高。　　 为了模拟人脑的微环境，用125nM Aβ作用于BV2胶质细胞单层，12h后，收集BV2细胞上清，加至HBMEC单层上，作用2h，CCR1、CCR2、CCR3、CXCR2、CXCR4、CXCR7及CX3CR1的表达增高，因此推断抑制MSC中的ROCK信号使其中的CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CXCL11、CXCL12表达增加与Aβ作用于内皮细胞导致的CCR1、CCR2、CCR3、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7及CX3CR1的增加，可能是促进MSC穿过Aβ沉积大鼠体内血脑屏障的原因。　　 结论：　　 1、本研究发现抑制MSCs的Rho/ROCK通路能够增强MSCs的迁移能力，促进MSCs穿过脑微血脑内皮细胞单层，而且这种促进作用可能与MSCs细胞骨架改变和MSCs引起HBMECs单层上紧密连接的去装配有关;　　 2、ROCK基因knock-down修饰的MSC穿过大鼠体内血脑屏障的能力显著升高;　　 3、ROCK基因knock-down修饰的MSC入脑能力增强可能与CCL3，CCL5，THBD1, CXCL11, CXCL12, CCL4, MMP9, AIF1,LCP1, MMP12,Fcgr3a,ceacam10等基因的表达增高有关。　　 4、在人脑微血脑内皮细胞上检测到CCL3，CCL5，CXCL11，CXCL12,CCL4对应的受体CCR1，CCR2，CCR3，CXCR2，CXCR4，CXCR7，CX3CR1，CXCR3的表达，并且这些受体的表达对Aβ具有时间和浓度依赖性，提示抑制MSC中的ROCK信号分子促进MSC穿过体内外血脑屏障的原因可能与上述这些配体-受体的表达增高有关。