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目的：肺癌最重要的生物学特征就是浸润和转移,其浸润和转移的程度影响癌症患者的预后和治疗效果,进一步研究肺癌恶性生物学行为的分子学基础至关重要。
本课题组前期实验已经采用激光显微俘获切割(LCM)及mRNA差异显示等技术,在肺癌标本中筛选和克隆出多个与肺癌转移相关的基因片段,应用RACE技术对新基因进行了全长cDNA的克隆及测序,并与Genebank序列进行了对比,发现新的肺癌相关基因ABCE1。ABCE1基因属ATP结合盒转运子基因亚家族,它的CDNA编码一种分子量为68KD的蛋白,又称核糖核酸酶L抑制因子。ABCE1蛋白位于细胞浆,分布于人体多处组织,能够阻断干扰素介导的2-5A/Rnase L细胞抗病毒通路,抑制细胞凋亡过程,并可能在促进蛋白质合成及细胞增殖分化过程中发挥着作用。
我们经过体外RNAi实验筛选ABCE1基因靶向的高效siRNA分子,并以此抑制SPCA1肺癌细胞ABCE1基因的表达,通过增殖能力、生长曲线、粘附实验、划痕修复实验、Transwell小室实验等体外细胞学实验,研究ABCE1基因表达抑制后,SPCA1肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化及分子机制。
Rho/Rho激酶是具有信息传导和分子开关功能的信号多肽。Rho家族蛋白是Ras超家族的一员,是一组相对分子量大约为20-25kD的三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白,具有GTP酶活性,又称为Rho GTP酶。Rho GTP酶通过GTP结合形式和GDP解离形式的转换,起着分子开关的作用。Rho/Rho激酶通路具有调控细胞形态改变、细胞与基质粘附及细胞骨架重组等生物学行为的作用。Rho激酶通路对于肿瘤细胞生长、浸润、转移有着重要作用,Rho家族的一些成员在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤组织中过表达。
本研究应用Rho激酶特异性抑制剂—法舒地尔干预95D肺腺癌细胞,观察此时肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变,从而评价Rho/Rho激酶通路在肺癌细胞增殖、转移过程中的作用。
方法：应用美国Ambion公司在线siRNA设计工具,针对ABCE1基因编码区进行干扰靶点的设计,在设计结果中根据Reynolds高效siRNA设计原则进行筛选,构建携带绿色荧光且可用于稳定转染的ABCE1基因沉默siRNA质粒,经电泳和DNA测序验证,证实ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA表达载体构建成功。将ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA转染SPCA1肺腺癌细胞株,G418筛选稳定封闭ABCE1基因的肺癌细胞株,结合RT-PCR,Western Blot检测RNA干扰效率。通过检测细胞增殖能力、生长曲线、粘附实验、划痕修复实验、Transwell小室实验等体外细胞学实验评价体外ABCE1基因稳定沉默后,SPCA1肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化及分子机制。用MTT方法检测Rho激酶特异性抑制剂—法舒地尔对95-D肺癌细胞的细胞毒效应,测定其IC50值。应用法舒地尔干预95-D肺腺癌细胞,通过粘附实验、划痕修复实验、Transwell小室实验、免疫组化,RT-PCR、Western Blot和明胶酶谱分析等体外细胞学实验评价选择性抑制Rho激酶通路活性后95-D肺癌细胞增殖和迁移能力的变化。
结果：成功的构建了携带绿色荧光且可用于稳定转染的ABCE1 siRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA。将其转染SPCA1肺腺癌细胞,转染48小时后转染效率较高,可达到50％以上,经G418筛选,成功筛选出了稳定封闭ABCE1基因的SPCA1肺腺癌细胞株。经RT-PCR,Western Blot检测显示,RNAi后SPCA1肺腺癌细胞ABCE1基因的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。与对照组相比,稳定封闭ABCE1基因后,SPCA1肺腺癌细胞的增值能力明显下降;生长曲线上升缓慢,增殖幅度降低,细胞生长明显延缓;粘附能力明显下降(P＜0.05);迁移和侵袭能力均明显降低(P＜0.01)。法舒地尔对95-D肺腺癌细胞的IC50值约为0.79 mg/ml(95％可信区间:0.58-1.11 mg/ml)。用0.75 mg/ml法舒地尔干预95D肺腺癌细胞,法舒地尔组与对照组相比:95D肺腺癌细胞粘附能力明显降低(P＜0.05);免疫组化检测显示迁移相关蛋白—基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达明显下降;明胶酶谱分析检测显示MMP-2和MMP-9分别下降22.7％(P＜0.05)和65.9％(P＜0.01);Western blot检测显示肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1(MYPT1)和MYPT1磷酸化水平(p-MYPT1)分别下降了13.9％(P＞0.05)和29.4％(P＜0.05)。
结论：
1、成功的构建了携带绿色荧光且可用于稳定转染的ABCE1 siRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA;
2、成功筛选出了稳定封闭ABCE1基因的SPCA1肺腺癌细胞株。;
3、体外行RNAi封闭ABCE1基因表达后可抑制SPCA1肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力;
4、选择性抑制Rho/Rho激酶信号通路活性能够抑制95D肺癌细胞的增殖和迁移能力。