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目的尽管伊马替尼（Imatinib,IM）的出现和普及显著改善了晚期胃肠间质瘤（Gastrointestinal Stromal Tumor,GIST）患者的预后,但大多数患者最终因IM耐药而导致疾病再次进展。本课题探索了可能导致IM耐药的新基因,探讨了BCL6在IM耐药中的作用和机制,以及逆转IM耐药的潜在策略。方法1.采用生物信息学分析方法,探索可能与GIST伊马替尼耐药相关的新基因,并用免疫组化染色分析、荧光定量PCR检测及免疫印迹试验（Western Blot,WB）验证;用CRISPR-Cas9技术,构建BCL6敲除的GIST细胞系;采用MTS法检测GIST细胞活力变化,采用流式细胞计数法检测GIST细胞凋亡变化,采用细胞集落形成试验GIST细胞增殖能力改变,采用划痕实验、Transwell侵袭和迁移实验检测GIST细胞的侵袭迁移能力变化;构建小鼠皮下异种移植瘤模型和GIST肝转移小鼠模型检测GIST肿瘤生长和侵袭转移能力变化;用免疫荧光染色分析GIST肿瘤增殖和凋亡变化。2.用X光射线瞬时照射处理GIST细胞发生DNA损伤,免疫荧光检测GIST细胞中不同待测因子foci形成情况,用中性彗星实验检测DNA损伤修复能力变化,在HEK293T细胞中使用DR-GFP/EJ5-GFP报告系统检测BCL6在不同DNA损伤修复途径中的作用,构建BCL6转录活性缺失突变载体,然后在BCL6敲除GIST-T1细胞中重新表达,分析BCL6是否通过其转录功能调控DNA损伤修复。在BCL6敲除细胞中过表达RPA2了解BCL6抑制是否能够通过RPA2聚集阻碍DNA修复从而增强IM抗肿瘤作用。3.构建耐药细胞系GIST-T1R,BI-3802联用IM分组处理进行体外和体内实验,以进一步验证BI-3802联合IM是否能够逆转GIST伊马替尼耐药。结果1.靶向BCL6增强IM在GIST中的抗肿瘤作用:生信分析结果显示,BCL6在经IM刺激诱导的GIST细胞中显著高表达,是GIST细胞经IM刺激后变化最显著的基因,该结果在后续验证中被进一步证实。构建BCL6敲除GIST细胞系并联合IM分组处理进行体外和体内实验,结果显示BCL6敲除联合IM可在体外和体内显著抑制GIST细胞增殖和侵袭迁移、促进GIST细胞凋亡、抑制GIST肿瘤生长和侵袭转移。BCL6抑制剂BI-3802联合IM分组处理行体内和体外实验,结果显示BI-3802联合IM可在体外和体内显著抑制GIST细胞增殖和侵袭迁移、促进GIST细胞凋亡、抑制GIST肿瘤生长和侵袭转移。2.BCL6促进DNA损伤同源重组修复（Homologous Recombination,HR）介导GIST对IM耐药:通过X光射线瞬时照射处理GIST,WB结果显示BCL6敲除可抑制GIST细胞DNA损伤修复;免疫荧光染色分析结果显示IM刺激可诱导GIST细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX foci水平显著升高;WB、免疫荧光染色分析及中性彗星实验结果显示BCL6敲除可抑制GIST细胞DNA损伤修复;DR-GFP/EJ5-GFP报告系统及免疫荧光检测53BP1、BRCA1和Ct IP foci结果显示,BCL6缺失显著降低HR修复效率而对非同源末端连接途径未产生显著影响;免疫荧光检测RPA2和RAD51结果显示,BCL6沉默可能通过RPA2抑制HR介导DNA双链断裂修复;通过构建BCL6转录活性缺失突变载体并在敲除BCL6的GIST细胞中重新表达BCL6,WB和免疫荧光染色分析结果显示BCL6依赖其转录功能调控HR修复;RT-PCR和WB检测结果显示,在BCL6敲低的GIST细胞中RPA2的m RNA水平和蛋白表达水平均显著下降,Ch IP检测结果表明BCL6没有RPA2的启动子区域相结合,BCL6在转录水平上间接调控RPA2表达调控HR修复;在敲除BCL6的GIST细胞中过表达RPA2并应用IM,分组处理进行体内和体外实验结果显示,与BCL6敲除组相比过表达RPA2组GIST细胞/肿瘤在体内和体外均未表现出显著增殖抑制、凋亡增加以及生长和侵袭转移抑制,过表达RPA2逆转了由靶向BCL6增强的IM抗肿瘤效应。3.BI-3802联合IM逆转GIST伊马替尼耐药:BI-3802联合IM显著抑制GIST-T1R细胞增殖和侵袭迁移、促进GIST-T1R细胞凋亡、抑制GIST-T1R肿瘤生长和侵袭转移。结论IM可诱导GIST细胞中BCL6显著高表达,BCL6可通过正向调节RPA2表达促进HR途径进行DNA损伤修复,并导致潜在的IM抵抗;抑制BCL6可以强烈减弱HR修复效应,因此使GIST细胞对IM敏感并逆转IM耐药,BCL6抑制剂BI-3802联合IM对解决IM耐药可能为一种潜在的治疗策略。