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研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性和自身免疫性疾病,可以引起急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)、急性脑梗死等严重的心脑血管事件,在全球范围内发病率和死亡率都在增加。炎症、氧化应激、脂质负荷增加等因素造成的血管内皮细胞(Vascular endothelial cells,VECs)损伤启动并贯穿AS全程。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是免疫系统中最有效的抗原呈递细胞,DCs在生理条件下以不成熟的形式存在于动脉壁,在AS斑块中数量显著增加,可通过促进巨噬细胞活化、诱导T细胞活化和增殖等方式在AS发生发展过程中发挥重要作用。DCs的成熟,即免疫耐受被抑制是DCs在AS过程中发挥作用的关键步骤。通过抑制DCs成熟来干预AS进程已成为关注热点。目前认为,从内皮细胞受损到DCs的迁徙与成熟化,其中存在着某种信号传递。外泌体(Exosomes,Exos)是生物体内许多细胞传递的小囊泡,是通过传递和交换供体细胞特异性蛋白质、m RNA、包括长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在内的非编码RNA(Non-coding RNA,nc RNA)等进行细胞间通讯的重要介质,在AS的发生、进展以及并发症等多个阶段均发挥了重要作用。肺腺癌转移相关转录子1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)基因是lnc RNA中的主要成员之一,新近研究显示,MALAT1基因敲除促进了AS进展,而过度表达可诱导心脏移植和自身免疫疾病中的DCs的免疫耐受。MALAT1可激活VECs中的核转录因子NF-E2相关因子(Nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)信号通路,Nrf2也参与调控DCs的活化、成熟和免疫耐受。然而,在AS环境下,MALAT1是否能通过外泌体参与血管内皮损伤到DCs的成熟这一重要环节,以及Nrf2在其中发挥了怎样的作用仍不清楚。探索AS进程中DCs成熟化的发生机制,有助于为疾病干预提供实验依据和理论支持。研究目的本研究将观察VECs经氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)处理后通过外泌体传递MALAT1的变化信息,进而通过MALAT1调控DCs成熟的现象,并探讨Nrf2信号通路在其中可能的作用机制。研究方法1.观察在AS环境下外泌体中MALAT1的变化纳入AS病人25例和健康人群20例,收集血清样本并分离外泌体。人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)分别以磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline,PBS)或ox-LDL处理,收集细胞上清并分离外泌体。Western blot检测外泌体标志物,实时荧光定量聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测以比较4组外泌体中MALAT1的表达水平;2.证实外泌体来源的MALAT1能否影响DCs的成熟化HUVECs中转染MALAT1过表达载体Lv-MALAT1,q RT-PCR结果表明MALAT1的表达在Lv-MALAT1转染的HUVECs来源的外泌体中上调。用亲脂性荧光染料Di O(绿色)标记HUVECs-Exos,并与用m Cherry质粒(红色)转染的未成熟的DCs(immature DCs,i DCs)共孵育。在激光共聚焦显微镜下分析i DCs摄入外泌体的情况。用PBS(Exos的对照)和不同的Exos(HUVECs-Exos,oxLDL-HUVECs-Exos,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-ctrl,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-MALAT1)与i DCs共孵育,q RT-PCR检测DCs中的MALAT1表达情况。用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(2μg/m L)、PBS(Exos的对照)和不同的Exos(HUVECs-Exos,,ox-LDL-HUVECs-Exos,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-ctrl,ox-LDLHUVECs-ExosLv-MALAT1)与i DCs共孵育。收集共培养后的i DCs细胞,加入荧光素标记葡聚糖(Fluorescein thiocarbamoyl dextrans,FITC-dextran)培养后,采用流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)分析FITC-dextran的摄取情况,以检测DCs细胞的抗原吞噬能力。FCM检测DCs细胞表面标志物CD80,CD86和人类白细胞DR抗原(Human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的表达情况;3.观察在上述过程中是否存在Nrf2信号激活用LPS(2μg/m L)、PBS(Exos的对照)和不同的Exos(HUVECs-Exos,oxLDL-HUVECs-Exos,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-ctrl,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-MALAT1)与i DCs共孵育,Western blot检测Nrf2,血红素加氧酶1和醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1,NQO1)在总细胞裂解物中的蛋白水平;Western blot检测Nrf2,HO-1和NQO1在核内的蛋白水平;活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)试剂盒检测ROS含量。4.验证MALAT1通过Nrf2信号通路影响DCs的成熟化通过RNA pull down和RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)方法验证MALAT1与Nrf2的结合关系;Western blot检测MALAT1过表达与MALAT1敲除对总细胞裂解物和核裂解物中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响。5.通过动物实验观察外源性外泌体中MALAT1的变化对小鼠AS的影响将50只Apo E-/-小鼠随机分为5组,分别为Control组,AS组,AS+PBS组,AS+VECs-Exos组,和AS+ox-LDL-VECs-Exos组。所有小鼠喂养12周,Control组用普通饮食,AS组、AS+PBS组、AS+VECs-Exos组和AS+ox-LDL-VECs-Exos组以高脂饮食喂养,其中AS+PBS组、AS+VECs-Exos组、和AS+ox-LDL-VECsExos组在第12周开始时分别接受PBS、小鼠VECs的外泌体(1.2μg/g)、ox-LDL处理小鼠VECs的外泌体(1.2μg/g)的静脉注射,1周2次。在第12周结束时,处死所有小鼠,采血提取血清,检测丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、ROS、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、白细胞介素12(interleukin-12,IL-12)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)。分离主动脉,进行组织学观察。研究结果1.AS病人血清来源的外泌体和ox-LDL处理的HUVECs来源的外泌体中MALAT1表达降低。2.LPS处理显著降低了DCs细胞内吞能力,增加了DCs标志物CD80,CD86和HLA-DR的表达,HUVECs-Exos减弱了LPS诱导的DCs成熟,ox-LDLHUVECs-Exos中外源性高表达MALAT1抑制DCs成熟。3.LPS处理下调Nrf2和其信号转导下游基因的蛋白水平,并对Nrf2核转位产生了抑制。HUVECs-Exos可抑制以上作用。与LPS+i DCs+HUVECs-Exos组相比,LPS+i DCs+ox-LDL-HUVECs-Exos抑制效果进一步减弱。与ox-LDL-HUVECsExosLv-ctrl相比,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-MALAT1显著上调Nrf2和下游基因的蛋白表达并促进Nrf2的核转位。此外,与ox-LDL-HUVECs-ExosLv-ctrl组相比,ox-LDL-HUVECs-ExosLv-MALAT1显著降低ROS含量。4.RNA pull down和RIP试验相互印证MALAT1和Nrf2之间的结合,进一步的研究显示MALAT1过表达显著上调Nrf2和下游基因的蛋白水平,并促进Nrf2的核转位。相反,MALAT1敲除下调上述蛋白水平,并抑制Nrf2的核转位。5.动物实验结果显示:小鼠VECs-Exos减轻了AS斑块和炎性细胞浸润,并降低血清氧化应激指标的含量和促炎细胞因子(IL-12和IL-6)的水平,还增加血清中抑炎细胞因子(IL-10和TGF-β)的水平。与AS+VECs-Exos组相比,AS+ox-LDL-VECs-Exos组中的小鼠显示出更多的AS斑块和炎性细胞浸润,更高的血清氧化应激指标的含量和促炎细胞因子的水平,以及更低的血清中抗炎细胞因子的水平。此外,与对照组相比,AS组中MALAT1表达显著降低。AS+VECs-Exos组血清MALAT1表达显著高于AS+PBS组。与AS+VECs-Exos组相比,AS+ox-LDL-VECs-Exos组血清MALAT1表达明显降低。研究结论1.在体和离体研究表明,氧化应激损伤后的HUVECs-Exos中的MALAT1的表达降低;2.ox-LDL处理的HUVECs-Exos的外源性MALAT1过表达能抑制树突状细胞的成熟;3.ox-LDL-HUVECs-Exos的外源性MALAT1过表达激活Nrf2信号通路,调节促炎因子等表达从而抑制ROS积累,进而抑制树突状细胞的成熟。4.Exos-MALAT1与Nrf2相互作用并激活DCs中的Nrf2信号通路,最终干预AS病理过程。