仿生骨修复支架材料的设计及其成骨诱导机制的研究

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骨组织疾病和缺损对于机体的结构和功能具有相当大的危害性。小面积的骨缺损是可以依靠机体自身的再生机制而痊愈的,而较大面积的骨缺损依靠机体自身的能力是无法修复的,这就需要借助植入材料来辅助破损组织的修复和痊愈。自体骨、异体骨和人工合成骨移植是目前临床上治疗骨缺损的主要方法。其中最有效的临床治疗方法就是自体骨移植,但是自体骨移植技术具有取材来源有限、功能性障碍、增加患者痛苦等不可避免的弊端,因此其广泛的临床应用受到了一定的限制。而基于如小牛骨来源的Bio-Oss或猪骨来源的OsteoBiol等材料的异体骨移植存在价格昂贵、加工费时等问题。因此,设计一种在结构上高度模拟天然骨组织基质,并具备良好的生物相容性和骨再生诱导能力的理想仿生骨修复支架材料是当前骨组织工程的热点问题。本文基于大量的研究基础,分别设计了仿生多级孔生物活性玻璃支架材料和PLLA纳米纤维支架材料并通过等离子体技术对其表面活性进行改良,表征其材料性质,评估其生物相容性和成骨诱导能力,对其成骨诱导机制进行研究,并将它们复合植入动物体内进行骨缺损修复实验,评价其修复效果。本研究首先以三嵌段共聚物(聚丙三醇-聚乙二醇-聚丙三醇)和毛海绵为模板制备了一种可用于骨组织修复的多级孔生物活性玻璃(MBG)微管支架材料。通过扫描电镜观察,发现该支架材料具有良好的多级孔结构。毛海绵的引入不仅形成了孔隙结构,而且在模拟体液(SBF)的环境下可有效地促进羟基磷灰石的生成。通过对在支架材料上培养的MC3T3-E1细胞的增殖能力进行检测,发现该材料具有良好的生物相容性。此外,地塞米松(DEX)载药实验证明此材料体系通过其特有的多孔结构具有良好的载药能力,并能够为周围环境提供一个持续给药的模式。通过以上实验证明这种多级孔MBG微管支架材料凭借其特有的多通道微孔结构,具备良好的生物活性和生物相容性,并且具有负载和持续释放药物的能力,从而体现出其作为骨修复支架材料应用于骨组织工程领域良好的应用前景。除多孔支架材料以外,纳米纤维支架材料是骨组织工程领域又一个热门的材料体系。纳米纤维在结构上可以模拟天然骨组织生长的细胞外基质(ECM),从而表现出优越的成骨诱导性。随着对纳米纤维支架材料研究的不断深入,不同排列方式的纤维取向可决定干细胞不同的分化方向成为该材料体系又一个热点议题。因此,本研究以左旋聚乳酸(PLLA)为原料,利用静电纺丝技术,分别以金属平板和滚筒为接收装置制备无纺和平行排列的纳米纤维支架材料。以人类骨髓间充质干细胞(BMSCs)为细胞模型,研究其在不同取向的纳米纤维上的成骨分化能力。结果发现BMSCs的形貌明显地受到纤维取向的影响:培养在无纺材料上的细胞呈现无规则、多分枝的形貌,而平行材料上的细胞沿着纤维排列的方向生长,呈现纤长的细胞形状。分别在细胞培养的第4,7,14和21天收集细胞并提取RNA进行qRT-PCR检测,结果发现RUNX2、BMP2、OPN、COL1A1、SPARC和BSP等成骨基因在无纺纳米纤维材料上的表达均高于平行材料。为了深入研究无纺排列的纳米纤维调控BMSCs成骨分化的机制,本研究又对培养于两种材料上不同时间(4,7,14和21天)的细胞进行基因芯片(Microarray)检测,通过对基因芯片结果的分析,发现无纺纳米纤维调控的成骨分化与化学诱导成分诱导的成骨分化具有类似的调控机制,而纳米纤维的调控作用要明显弱于化学诱导作用。基于KEGG的信号通路分析显示这种纳米拓扑结构作用下的成骨分化是通过细胞粘附引起细胞内的力学传导效应,这些力学传导效应又通过激活TGF-β、Wnt和MAPK等成骨分化相关的信号通路来促进BMSCs向成骨细胞分化。这些实验结果证明培养在无纺纳米纤维支架材料上的BMSCs处于一个成骨分化的活跃状态,而且也证明了支架材料表面的拓扑学结构对细胞功能的调控作用,在骨修复支架材料的设计和研发方面具有一定的参考价值。通过上述对不同取向的纳米纤维材料的成骨功能研究,肯定了无纺排列的纤维结构更有利于BMSCs的成骨分化。然而,PLLA材料本身具有的表面惰性和疏水性会限制其在生物医用材料领域的应用。因此,本研究利用低温大气等离子体技术改良无纺PLLA纳米纤维材料的表面性质,以期得到更好的成骨活性。我们分别利用等离子体处理纳米纤维材料1,5和10分钟,检测其表面特性的改变,并研究这种改性对BMSCs生物学行为的影响。结果发现材料表面的氨基基团和亲水性都随着处理的时间而增加,而BMSCs在经过5分钟处理的材料上增殖和铺展最明显,顺次是1分钟和10分钟的处理材料。qRT-PCR分析显示经过5分钟处理的纳米纤维材料能够有效促进骨形态发生蛋白2(BMP2)、RUNX2、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(COL1A1)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达。此外,通过ALP活性检测实验还证明5分钟处理的纳米纤维材料上培养的BMSCs也具有最大的ALP活性。这些结果证明等离子体技术是一种可行的、有效的改良PLLA纳米纤维表面特性、生物相容性和成骨活性的技术,并为新型骨修复材料的研发和改良提供了一定的理论基础。为了评价本研究制备和改良的MBG材料和纳米纤维材料在体内环境下的骨修复效果,我们将负载DEX的MBG材料和经等离子体处理5分钟的PLLA纳米纤维材料复合植入兔下颌骨缺损部位。分别于植入后的第4周和第12周对缺损处的骨组织进行取样和检测,结果发现它们对骨组织的修复效果良好,12周后基本完成了新生骨组织与周围正常骨组织的整合,其修复效果与经典修复材料十分相近。以上实验证明MBG微管材料和经等离子体处理后的PLLA纳米纤维材料的复合植入可显著地引导骨组织再生,加快骨修复进程,并可有效地改善新生骨组织的质量。
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