论文部分内容阅读
植物甜蛋白是从植物种分离提取到的植物蛋白,由于甜蛋白甜度高、热量低、比合成甜味剂安全,不会导致肥胖、安全无毒等优点[1],使得甜蛋白作为新型甜味剂,广受青睐。本研究主要目的是探索MabinlinⅡ甜蛋白在原核生物中的表达以及检测表达的蛋白的甜味。野生马槟榔植株主要分布在云南和广西等热带和亚热带地区,由于地理气候等自然原因,马槟榔植株数量稀少,濒危灭绝。本研究预期借助大肠杆菌表达载体,表达优化过的MabinlinⅡ甜蛋白基因,探究甜蛋白是否能大量表达。为MabinlinⅡ甜蛋白的开发提供一些理论基础。目前MabinlinⅡ甜蛋白基因已经能够在大肠杆菌中表达,为了进一步提高表达量以及测定其甜味活性,在NCBI查询得到MabinlinⅡ甜蛋白基因全长序列,依据大肠杆菌对密码子的利用率不同,将稀有密码子置换为常用密码子,对468 bp长度的转座酶密码子进行了优化。本研究目的则是使用pET28a（+）作为克隆表达载体,E.coli BL21（DE3）作为表达菌,表达出密码子优化后的468 bp长度MabinlinⅡPlus甜蛋白基因和去掉序列中编码氨基酸的信号肽、N-端肽,C-端肽的321 bp长度的MabinlinⅡ（AB）Plus,比较这两段序列那种能更好的表达蛋白,并研究如何能提高蛋白表达量,为了获得更高效的表达,本研究还进行了表达条件优化,并用Western Blot对所表达的蛋白进行鉴定,用Ni-NTA琼脂糖树脂介质对得到的蛋白进行纯化,最后通过感官评定实验和电子舌测定对目的蛋白进行甜味测定。本实验主要分为四个部分。第一部分为重组表达载体的构建,首先依据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对MabinlinⅡ甜蛋白基因编码区序列（GI:1817545）的密码子进行优化,优化后的MabinlinⅡ甜味蛋白基因命名为MabinlinⅡPlus,去掉MabinlinⅡPlus序列中的信号肽、N-端肽,C-端肽,剪切后的基因命名为MabinlinⅡ（AB）Plus。用BamHI和XhoI分别对含有基因序列MabinlinⅡPlus和MabinlinⅡ（AB）Plus的克隆载体以及表达载体pET28a（+）的限定位点分别剪切,用T4 DNA连接酶将表达载体pET28a（+）分别与基因序列MabinlinⅡPlus和MabinlinⅡ（AB）Plus连接。根据用基因MabinlinⅡPlus和MabinlinⅡ（AB）Plus分别设计合适的PCR扩增引物对,将重组质粒pET28a（+）-MabinlinII Plus和pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus分别转化到DH5α感受态,平板划线过夜培养后用菌落PCR,取0.2 mL电泳结果阳性的质粒的菌液送往测序公司。测序成功的序列与原序列用BioEdit比较核苷酸序列。序列对比结果表明,重组表达载体pET28a（+）-MabinlinII Plus和pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus构建成功。第二部分为重组载体pET28a（+）-MabinlinII Plus和pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus的原核表达、表达条件的优化。本实验中选择BL21（DE3）作为表达的宿主菌,使得两个重组载体质粒在BL21（DE3）中表达,用SDS-PAGE（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析。实验结果表明,重组载体pET28a（+）-MabinlinII Plus在蛋白分子量大约为26.0 kDa处有相对应的条带出现,经过对诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间,诱导的起始生长量OD600等表达条件的优化,始终未见表达量有所提高;而重组载体pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus有明显的有明显的诱导表达条带,而且经过表达条件优化后蛋白条带有明显加深,即目的蛋白得到大量表达。将基因未经优化的重组载体BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinII（AB）与优化后的重组载体BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus在最优条件下进行诱导表达,取总蛋白SDS-PAGE分析,经Band-Scan凝胶成像系统分析,显示基因优化后的重组载体BL21（DE3）/pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus的表达量为33%,优化前的表达量为26%,基因优化后的重组载体的表达量比基因优化前提高了7%。第三部分为克隆载体pET28a（+）-MabinlinII（AB）Plus在BL21（DE3）产生的目的蛋白的纯化和鉴定。将大肠杆菌产生的菌体总蛋白用SDS-PAGE电泳分析,可观察到在19 kDa有符合预期的蛋白带,故我们采用Ni-NTA琼脂糖树脂介质,将反复冻融、超声破碎、离心取得的上清进行蛋白纯化,将最终收集的纯化样品用SDS-PAGE分析,并用Western Blot对所表达的蛋白进行鉴定。结果表明,目的重组蛋白即为基因优化后的MabinlinⅡ甜蛋白。第四部分为MabinlinⅡ甜蛋白的甜味检测。选择两种甜味检测方法,第一种是感官检测,采用“A”-非“A”试验,评定人员品尝后能准确找出样品并说出样品味觉特点,与蔗糖标准溶液对比,样品有强烈的后甜感,可以明显将样品与对照区分开;“双盲”感官检验对样品进行评测结果显示甜蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。第二种是利用仿生电子舌对样品进行定性和定量分析。用蔗糖、氯化钠、硫酸镁、柠檬酸、谷氨酸钠对照,比较样品的风味;测定不同浓度梯度的蔗糖溶液,做标准曲线,定量分析结果显100 mL大肠杆菌生产的MabinlinⅡ甜蛋白的甜度等同于0.4 g纯度为99.7%的蔗糖的甜度。