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睾丸是雄性动物产生睾酮和精子发生的重要场所，睾酮不仅可以促进精子发生和维持雄性动物第二性征，并且对机体生长发育非常重要。在动物生产中，将雄性动物去势会使其更加温顺，生长速度更快。在医学上，去势诱导睾酮缺乏是研究雄性动物生殖障碍的重要模型。研究表明，在雄性动物初情期前进行半去势手术可导致睾酮缺缺乏，从而显著降低精子质量。MicroRNAs(miRNAs)是一类真核细胞中广泛存在的小分子非编码RNA，可以在转录后水平调控基因表达从而参与多种生物学过程。到目前为止，还没有从miRNAome角度系统研究初情期前的半去势手术对精子的作用，以及miRNA是如何通过相关调控和功能变化影响精子质量。本研究对大白猪进行半去势手术以构建睾酮缺乏模型，通过small RNA-seq技术分别对半去势组和对照组的精子和精液外泌体中的miRNA转录组进行测序，鉴定miRNAome的差异，并对候选miRNA进行功能验证。本研究主要结果如下:
(1)通过半去势手术构建睾酮缺乏模型，通过将HC组(n=15)和CT组(n=15)之间的各项参数进行比较，结果发现体重、体长、脏器指数变化不显著，但睾酮水平显著下降，睾丸重量显著增加，精液质量显著下降(P＜0.01)，表明成功构建睾酮缺乏模型构建成功。
(2)采用small RNA-seq对HC组(n=3)和CT组(n=3)精子进行测序，经过一系列比对，最终在6个测序文库中鉴定出396种已知的前体miRNA编码206种成熟的miRNA。以miRNA表达量Fold-change＜0.5或＞2，且两组之间P value≤0.05为标准，发现文库中有16个差异表达的miRNA，且在两个测序文库之间有不同的表达方式，与此同时，两个测序文库之间所有差异表达的miRNA都是被下调的。
(3)与此同时，分别将两组之间的miRNA按照表达量进行排序，并用不同的颜色显示表达量Top10位的miRNA，结果显示，两组之间精子测序文库中的Top10位的miRNA中共同存在的miRNA有8个，表明精子细胞中高表达的miRNA在维持精子细胞功能有着显著的作用。
(4)通过DIANA功能富集分析软件对16个差异表达的miRNA进行功能富集分析，结果发现，差异表达的miRNA富集在HIF-1通路、细胞循环通路以及细胞凋亡相关的通路中，包括:p53、MAPK和mTOR途径，且75％(12/16)差异表达的miRNA富集在p53通路中。
(5)为验证差异表达的miRNA能否影响精子的质量，通过上游法筛选出高质量精子用于精子转染试验，转染结束后测定包括精子直线运动速度(VSL)、精子曲线运动速度(VCL)、精子路径运动速度(VAP)在内的相关参数。结果表明，包括miR-26a-5p，let-7g-5p都具有潜在的抗凋亡效果。
(6)通过双荧光素酶报告系统证明证实PTEN和PMAIP1分别是miR-26a-5p和let-7g-5p的靶基因。miRNA过表达和抑制试验显示miR-26a-5p和let-7g-5p分别通过抑制凋亡相关的靶基因PTEN和PMAIP1，进而通过p53等通路影响精子细胞的凋亡。
(7)利用超高速离心法从精子精清中分离出精子外泌体，通过sperman corrlation证实精子miRNAome与精清外泌体miRNAome之间的相关性CT组r=0.733，HC组r=0.719，两者的相关系数显示两者为中度相关。与此同时，精清外泌体miRNAome中HC组和CT组聚类分析亦显示出与精子miRNAome类似的分离效果。
综上所述，研究结果表明，精清中可能会产生包括miRNA在内的遗传调控物质，充当信号传导介质，并在p53信号通路中发挥功能调节作用，用于帮助精子延长与卵子结合的时间，并最终繁衍下一代的目的。
(1)通过半去势手术构建睾酮缺乏模型，通过将HC组(n=15)和CT组(n=15)之间的各项参数进行比较，结果发现体重、体长、脏器指数变化不显著，但睾酮水平显著下降，睾丸重量显著增加，精液质量显著下降(P＜0.01)，表明成功构建睾酮缺乏模型构建成功。
(2)采用small RNA-seq对HC组(n=3)和CT组(n=3)精子进行测序，经过一系列比对，最终在6个测序文库中鉴定出396种已知的前体miRNA编码206种成熟的miRNA。以miRNA表达量Fold-change＜0.5或＞2，且两组之间P value≤0.05为标准，发现文库中有16个差异表达的miRNA，且在两个测序文库之间有不同的表达方式，与此同时，两个测序文库之间所有差异表达的miRNA都是被下调的。
(3)与此同时，分别将两组之间的miRNA按照表达量进行排序，并用不同的颜色显示表达量Top10位的miRNA，结果显示，两组之间精子测序文库中的Top10位的miRNA中共同存在的miRNA有8个，表明精子细胞中高表达的miRNA在维持精子细胞功能有着显著的作用。
(4)通过DIANA功能富集分析软件对16个差异表达的miRNA进行功能富集分析，结果发现，差异表达的miRNA富集在HIF-1通路、细胞循环通路以及细胞凋亡相关的通路中，包括:p53、MAPK和mTOR途径，且75％(12/16)差异表达的miRNA富集在p53通路中。
(5)为验证差异表达的miRNA能否影响精子的质量，通过上游法筛选出高质量精子用于精子转染试验，转染结束后测定包括精子直线运动速度(VSL)、精子曲线运动速度(VCL)、精子路径运动速度(VAP)在内的相关参数。结果表明，包括miR-26a-5p，let-7g-5p都具有潜在的抗凋亡效果。
(6)通过双荧光素酶报告系统证明证实PTEN和PMAIP1分别是miR-26a-5p和let-7g-5p的靶基因。miRNA过表达和抑制试验显示miR-26a-5p和let-7g-5p分别通过抑制凋亡相关的靶基因PTEN和PMAIP1，进而通过p53等通路影响精子细胞的凋亡。
(7)利用超高速离心法从精子精清中分离出精子外泌体，通过sperman corrlation证实精子miRNAome与精清外泌体miRNAome之间的相关性CT组r=0.733，HC组r=0.719，两者的相关系数显示两者为中度相关。与此同时，精清外泌体miRNAome中HC组和CT组聚类分析亦显示出与精子miRNAome类似的分离效果。
综上所述，研究结果表明，精清中可能会产生包括miRNA在内的遗传调控物质，充当信号传导介质，并在p53信号通路中发挥功能调节作用，用于帮助精子延长与卵子结合的时间，并最终繁衍下一代的目的。