亮氨酸脱氢酶（LeuDH,EC 1.4.1.9）是一种来源广泛且在生物体内广泛参与众多支链型氨基酸代谢合成的关键酶,其在辅因子NAD（H）作用下能够可逆催化L型氨基酸和相应α-酮酸的相互转化。由于其对NAD（H）辅因子的严格偏好性以及有限的底物谱都限制其在工业催化方面的运用价值。非天然氨基酸（UAAs）中的D-氨基酸在医药领域具有非常重要的作用,目前能够通过酶催化酮酸生成相应的D-氨基酸的只有膜结合蛋白meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶（meso-DAPDH）,但是其催化活性极低。通过定向进化改变LeuDH的底物谱进而用于D-氨基酸的合成研究还有待突破。蛋白质工程是一种强有力的通过修饰酶结构而获得优势酶的手段,但是运用定向进化技术存在着构建有效覆盖酶蛋白基因突变文库和高通量筛选目标蛋白两大问题。通过酶蛋白活性中心结构分析针对特定的氨基酸定点突变的半理性设计方法可以有效克服定向进化存在的两大难题。本论文我们以来源于Exiguobacterium sibiricum 255-15的亮氨酸脱氢酶（EsiLeuDH）为研究对象,建立了一种高效SDASM半理性设计方法对EsiLeuDH进行工程改造,期望获得能够改变EsiLeuDH有限底物谱进而合成包括D-氨基酸在内的高价值手性氨基酸的突变酶蛋白。本篇论文主要研究内容如下:1.构建了 BL21（pET28-EsiLeuDH）重组菌株能够高效表达EsiLeuDH酶蛋白,测定其对氨基酸酶活性,结果表明EsiLeuDH对其中8种直链L-氨基酸具有活性,对D-氨基酸无催化活性。对EsiLeuDH的酶学性质进行探究,发现不论对L-Leu的氧化脱氨反应还是相应酮酸的还原胺化反应,其最适的反应温度和pH均分别为50℃和9.5。此外测定了金属离子对EsiLeuDH酶活的影响,发现EsiLeuDH因其具有-SH基团而使其在Ag+存在下完全失活。同时还测定了EsiLeuDH的热稳定性,根据测定不同温度下的半衰期来评估酶的稳定性,其中EsiLeuDH在30℃时的半衰期高达300h,具有良好稳定性。通过测定EsiLeuDH的动力学参数以及结合荧光光谱和紫外光谱、分子对接等手段针对EsiLeuDH催化天然底物L-Leu的催化机制进行了分析。2.建立了一种基于EsiLeuDH酶蛋白结构模型高效的SDASM半理性设计方法,通过该方法对EsiLeuDH活性中心位点进行工程设计,精准锁定K89和A122氨基酸残基构建小型智能突变库,经过筛选得到突变株K89T和A122G,表达和纯化两株突变体蛋白并测定其底物谱。结果发现单突变体K89T分别对Asn和Thr有催化活性,A122G分别对Phe、His和Met有催化活性,而WT EsiLeuDH对上述氨基酸没有催化活性,且A122G突变子对于底物L-Ile的催化活性高达5500 mU/mg。测定它们的酶学性质发现,K89T和A122G氧化脱氨反应的最适反应温度分别为35℃和55℃,最适反应pH分别为11.5和10。此外,还结合了单突变体的动力学和结构相互作用图分析其与底物结合的催化机制。3.为了进一步验证SDASM方法的有效性,我们应用SDASM半理性设计方法对EsiLeuDH进行工程改造使其能够改变手性选择性催化合成D-氨基酸。分别对选定的EsiLEuDH酶蛋白的G51和L52位点进行定点饱和突变,从中筛选得到的突变体G51K可能具有催化合成D-tert-Leu的潜在能力,突变体L52C对包括L-Val、Leu、Ile和Met等在内的10种氨基酸的活性均高于WT。在此基础上,我们构建的双突变体G51K/L52C对L-Val、Leu、Ile、Met、Ala、Lys这6种氨基酸有活性,其中对底物L-Ile的酶活最高达到6.5 U/mg与WT相近,但是对于L-Val和Leu的活性远低于WT。此外测定了 G51K、L52C和G51K/L52C突变体氧化脱氨反应方向的最适反应温度分别为45℃、35℃和45 ℃,最适反应pH分别为11.5、10.5和10.5。此外,还测定了各突变体的动力学参数并分析了其与底物结合机制。