牡丹属于芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect.Moutan）,是重要的观赏花卉和药用植物。近年来,人们发现牡丹也是一种优良的油料作物,具有产量高、产油率高、油质优等特点;其中牡丹籽油α-亚麻酸（α-linolenic acid,ALA）含量高达40%以上,对于改善人类健康具有重要意义。牡丹是可持续利用的新型木本油料植物,同时也是研究种子α-亚麻酸代谢的好模型。目前,牡丹油脂代谢的分子机制研究刚起步,有关脂肪酸合成相关基因的克隆和功能验证也鲜有报道。本研究对中国仅有的9种野生牡丹脂肪酸水平进行了系统评价,同时利用高通量测序技术分析了紫斑牡丹（P.rockii）、狭叶牡丹（P.potaninii）和黄牡丹（P.lutea）种子发育过程中转录组的差异,在此基础上利用RACE和转基因技术,对脂肪酸代谢关键基因进行克隆和功能验证。本项目为研究牡丹种子高效积累ALA的分子机制奠定了基础,也为进一步应用分子标记辅助育种培育优良油用牡丹新品种提供了新的基因元件。主要取得以下结果:1.对中国野生牡丹脂肪酸水平进行评价。发现9种牡丹总脂肪酸含量分为高、中、低三个等级,其中,紫斑牡丹（Paeonia rockii）、四川牡丹（P.decomposita）和卵叶牡丹（P.quii）总脂肪酸含量明显高于普通栽培品种。气质联用（GC-MS）检测发现不同种间脂肪酸组成相似,主成分为ALA、亚油酸（LA）、油酸（OA）、棕榈酸（PA）和硬脂酸（SA）;但种间脂肪酸含量差异较大,总脂肪酸含量最低为150.09 mg.g^-1,而最高可达271.82 mg.g^-1。我们还发现授粉后20-60d是脂肪酸积累的关键时期,该时期脂肪酸的合成速率将会直接影响最终成熟种子中脂肪酸的含量。RT-PCR结果显示紫斑牡丹β-PDHC、SAD、FATA、FAD2、FAD3和LPAAT等基因在种子发育过程中的转录水平均明显高于狭叶和黄牡丹,其表达模式与种子中脂肪酸的变化基本一致,因此我们建议上述基因可能是牡丹脂肪酸合成的关键基因。此外,研究还发现紫斑牡丹之所以拥有更高水平的ALA可能得益于FAD3高丰度的转录。2.构建了紫斑牡丹、狭叶牡丹和黄牡丹种子授粉后20d、60d和80d的cDNA文库,并进行了转录组测序。共得到62094条unigenes,其中有31466条unigenes在不同种间差异表达。生物信息学分析发现有186个unigenes与脂肪酸合成和积累相关;其中有多个编码脂肪酸脱氢酶的unigenes在油脂快速合成时期表达水平显著上调,且在不同野生牡丹中的表达水平存在差异。通过分析不同野生牡丹种子发育过程中转录组差异及脂肪酸含量的变化趋势,最终绘制了牡丹种子中脂肪酸和TAG的合成途径;进一步分析显示紫斑牡丹种子中高含量的α-亚麻酸与其高效的PC-衍生途径有直接关系,此外紫斑牡丹较强的Kennedy途径以及脂肪酸从头合成途径也在其脂肪酸合成和组装过程中发挥了关键作用。3.从紫斑牡丹种子中克隆并鉴定了两个编码溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）的基因,命名为PrLPAAT1和PrLPAAT4,二者的cDNA全长分别为1047bp和1116bp,各自编码一个含有348和371个氨基酸残基的蛋白,GenBank登录号分别为KX256278和KX256279。亚细胞定位显示PrLPAAT1和PrLPAAT4均为细胞膜蛋白;保守基序分析表明PrLPAAT1和PrLPAAT4属于AGPAT家族,可能具有酰基转移酶的活性;系统进化树显示PrLPAAT1与耧斗菜AcLPAAT1高度同源,PrLPAAT4与克莱门柚CcLPAAT4、杨树PtLPAAT4、木薯MeLPAAT4和蓖麻RcLPAAT4高度同源。qRT-PCR结果显示两个基因在根、茎、叶等营养器官中的表达量相对较低,在种子和花中的表达量相对较高。PrLPAAT1的表达与授粉后20-70天内的总脂肪酸含量变化趋势基本一致,而此时PrLPAAT4表达量也维持在较高的水平,表明PrLPAAT1和PrLPAAT4可能是在牡丹种子发育早期的脂肪酸合成过程中发挥作用。4.转基因数据显示,PrLPAAT4在拟南芥中异位表达,将会提高种子的重量以及单株产量,其中L4OX-28株系的百粒重和单株产量相对于野生型分别增加了19.9%和29.9%。进一步分析脂肪酸含量变化发现,PrLPAAT1和PrLPAAT4过表达转基因纯合株系的总脂肪酸含量均显著增加,其中L4OX-22和L4OX-28株系相对于Col-0增幅为3.4%和10.2%,L1OX-19株系相对于Col-0增加了11.8%。此外,PrLPAAT1和PrLPAAT4在拟南芥中异位过表达,对种子中脂肪酸的比例产生一定影响。相对于Col-0,PrLPAAT4过表达株系种子中油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）的含量显著增加,而PrLPAAT1过表达株系种子中棕榈酸（C16:0）和亚油酸（C18:2）的含量明显增高。另外,PrLPAAT4过表达转基因植株的不饱和脂肪酸的比例较Col-0略有下降,PrLPAAT1过表达转基因植株的18碳脂肪酸与20碳脂肪酸的比值相对Col-0有明显降低。利用qRT-PCR对转基因株系中蔗糖代谢、糖酵解途径以及脂肪酸合成和积累相关基因的表达进行分析发现,PrLPAAT4过表达转基因纯合株系种子中AtACP1、AtBCCP2和AtFPA1等基因的表达量相对于Col-0显著升高,而PrLPAAT1过表达转基因纯合株系种子中AtACP1、AtDGAT1和AtSUS3等基因的转录水平明显增加。5.从紫斑牡丹种子中克隆并鉴定了5个脂肪酸去饱和酶基因,命名为PrSAD、PrFAD2、PrFAD3、PrFAD6和PrFAD7,其cDNA全长分别为678bp、1155bp、1308bp、1230bp和1353bp,各自编码一个含有225、384、435、409和450个氨基酸残基的蛋白。在5个脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列中均含有一个FA-acyltransferase保守结构域。系统进化树显示,牡丹5个脂肪酸去饱和酶基因均和芍药对应的脂肪酸去饱和酶基因聚在一起,说明牡丹和芍药的亲缘关系较近,这完全遵从于二者同为芍药科芍药属的分类关系。组织表达结果显示,上述5个基因在种子和雌蕊中的表达量均相对较高。种子发育过程中的qRT-PCR结果显示,PrSAD、PrFAD2和PrFAD3是紫斑牡丹脂肪酸合成过程中的关键基因,而PrFAD6和PrFAD7在该过程中似乎并没有发挥显著的作用,再次证明内质网上的PC衍生途径是牡丹多不和脂肪酸合成的主要代谢途径。