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先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HD)又称肠无神经节细胞症,是一种神经嵴细胞源性疾病和多基因遗传病,其主要病因是患儿在胚胎期神经发育过程中,神经嵴细胞迁移障碍,肠神经发育出现停顿,肠壁肌间神经丛的神经节细胞缺失,以致受累肠段异常收缩,其近端结肠代偿性扩张与肥厚,形成巨结肠。HD是新生儿期低位肠梗阻常见原因之一,发病率占成活新生儿的1/5000。在先天性巨结肠症患者中,70%的患者为单发,12%的病例合并常染色体疾病,18%的病例合并有其他先天性畸形。对单纯性HD的研究表明,HD患者同胞的发病根据性别和无神经节肠段的长度不同,其再发病率为1%～33%,因此HD被认为是性修饰多因素遗传病。其中基因因素的影响发挥着非常重要的作用。至今为止已发现原癌基因RET以及分别编码胶质细胞源性神经营养因子(glial calline-derined neurotrophic factor,GDNF),内皮素B受体(endothelinβreceptor,EDNRB),内皮素3(endothelin3,EDN3),内皮素转换酶1(endothelin convertingenzyme 1,ECE1),neurturin(NTN),转录因子SOX10以及SIP1(smad-interactingproteinl)等基因与HD有关。同时微环境变化导致神经嵴细胞分化障碍引起HD这一学说越来越引起人们的重视。研究发现很多促进轴突生长和/或生长导向因子,如神经生长因子、成纤维细胞生长因子、细胞粘附因子(CAMs),其中, CAM可通过介导细胞一细胞之间的相互作用而调节多种细胞的生长和发育;神经系统中,其特有的细胞粘附因子NCAM、L1CAM、N-cadherin对于神经元网络的形成,包括神经元的迁移、神经细胞轴突的生长以及轴突的束状成形是必不可少的。现在已充分地认识到FGFR-CAM同源性结构域在所有FGFRs与N-cadherin,NCAM以及L1CAM间具有高度的保守性。一、细胞粘附分子CAMs在先天性巨结肠中的表达研究有些神经节细胞缺如是神经嵴细胞移行到正常位置后由于微环境变化导致分化障碍而引起的。轴突的方向性生长与微环境密切相关是突触形成的基础。已经发现了很多促进轴突生长和/或生长导向因子,如神经生长因子、成纤维细胞生长因子、细胞粘附因子(CAMs)如NCAM,L1CAM以及N-calherin等。细胞粘附因子(CAM)通过介导细胞-细胞之间的相互作用而调节多种细胞的生长和发育,近来有研究发现CAM通过与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合(CAM-FGFR信号传递)途径而刺激神经元突起的生长。鉴于考虑CAM-FGFR信号传递发生改变可能是导致HD主要神经元异常的原因之一,本课题选取NCAM、N-cadherin两种细胞粘附分子,研究它们在HD肠壁中的表达情况,初步探讨CAM-FGFR信号传导在HD致病机理中的作用。我们根据HE和AchE染色,将16例HD患者的标本分别分为神经节正常肠段(ganglionic segments,NG)和神经节缺如肠段(aganglionic segments,AG)两组,进行免疫组织化学染色。观察了HD患者细胞粘附分子(CAMs)分别在HD神经节正常肠段和神经节缺如肠段的表达情况。结果发现细胞粘附分子NCAM在神经组织和平滑肌组织中都有表达,但NG肠段肠组织中NCAM染色的正常的神经纤维的数量明显多于AG肠段;细胞粘附分子N-cadherin在神经组织和平滑肌中也都有表达,且同样在NG肠段平滑肌中N-cadherin染色的正常的神经纤维数量明显要多。结果表明细胞粘附分子(CAMs)在AG肠段的明显减少说明HD患者中CAM-FGFR信号传导发生了异常,且可能是导致肠神经母细胞移行障碍的原因之二、RET基因多态性与中国汉族人群先天性巨结肠的相关性研究相对环境而言,遗传因素在HD发生中起着更为重要的作用。RET原癌基因是最早发现,证据最确凿,作用最重要的与HD相关的基因。它定位于10q11.2,长约80kb,有20个外显子,编码产物为酪氨酸蛋白激酶受体。目前在HD病人中发现RET的突变性分散,无热点区域存在,极少数为大片段缺失,多为点突变、错义、无义和移码突变。20个外显子中,在西方人群已发现有7个常见的基因多态性,其中第45位密码子(GCG→GCA)和第769位密码子(CTT→CTG)的基因多态性与HD表型显著相关[1,2],但由于遗传背景等方面的差异,这一点需要在不同的人种和种族中进行证实,而有关RET基因多态性及基因频率在亚洲人群中的分布还未见报道。鉴于还无亚洲人群的RET基因多态性及其与HD的相关性研究,研究应用PCR-RELP在中国人群中检测对照组(n=122)及散发性先天性巨结肠组(n=94)G45A(GCG→GCA)、T769G(CTT→CTG)、G691A(GGT→AGT)和C904G(TCC→TCG)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)分析了94例HD患者和122例健康人其中G45A(GCG→GCA),T769G(CTT→CTG),G691A(GGT→AGT)和C904G(TCC→TCG)四个位点的基因多态性,探讨其基因多态性与先天性巨结肠的关系。结果发现G45A、T769G和G691A在中国人群中均存在多态性,但未发现C904G在中国人群中存在基因多态性,均为CC型。G45A在正常对照和疾病组中基因型频率分别为:对照组,AA 0.17、AG 0.72、GG 0.11,突变型A和野生型G等位基因的频率为0.53、0.47;HD组,AA 0.61、AG 0.35、GG 0.04,突变型A和野生型G等位基因的频率为0.78、0.22;T769G在正常对照和疾病组中基因型频率分布分别为:对照组,GG 0.30、GT 0.52、TT0.18,G和T等位基因的频率为0.56、0.44;HD组,GG 0.49、GT 0.36、TT 0.15,突变型G和野生型T等位基因的频率为0.67、0.33。两个位点的基因型和等位基因的分布频率在两组间均有显著性差异(ax2=28.64,p<0.001;bx2=5.27,p=0.022)。G691A在正常对照和疾病组中基因型频率分别为:对照组,AA 0.05、AG 0.16、GG 0.79,突变型A和野生型G等位基因的频率为0.13、0.87;HD组,AA 0.02、AG 0.14、GG 0.84,突变型A和野生型G等位基因的频率为0.09、0.91,在两组间未见有显著性差异(cx2=1.232,p=0.267)。结果表明RET密码子904在中国人群中可能不存在基因多态性,未发现G691A与先天性巨结肠存在相关性,而G45A和T769G的基因多态性可能与中国汉族人群先天性巨结肠相关。三、RET基因启动子单核苷酸多态性对基因表达影响的研究胚胎发育期间RET信号传导通路的激活对于肠神经系统前体干细胞的定向迁移是非常重要的。在家族性和散发性先天性巨结肠症病例中均发现有不同频率的RET基因功能散失性的胚系突变。而且在白种人群和本实验第二部分中均证实在先天性巨结肠症病患中RET基因上的一些基因多态性的等位基因存在过度表达或降低表达的现象。基因启动子区域的某些特定的等位基因能影响基因的表达,因而可能导致一些复杂疾病的易患性。本课题扩增RET基因上游启动子区域的片段,克隆入pGEM-T载体,用pfx高保真酶测序进行单核苷酸多态性检测(SNP),发现在中国湖北地区汉族人群中,启动子-6存在G>A单核苷酸多态性。并通过测序将检测到的单核苷酸多态性的纯合子区分出来(-6AA或-6GG),进而构建双重虫荧光素酶报告基因系统研究这个SNP对基因转录的影响。即分别构建含有这个单核苷酸多态性位点纯合子的虫荧光素酶报告基因质粒A-pGL3 Basic和B-pGL3 Basic,并将质粒瞬时转染体外培养的神经母细胞瘤细胞IMR32,检测两个体系的虫荧光素酶相对表达量。结果,含A纯合子等位基因启动子的IMR32荧光素酶相对表达量为1.58±0.15,含G纯合子等位基因启动子的IMR32荧光素酶相对表达量为4.14±0.35,G等位基因对HepG2荧光素酶相对表达量的影响明显高于A等位基因(p<0.001),说明-6G>A单核苷酸多态性与RET启动子的活性密切相关,能影响mRNA的转录。