鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性烈性传染病,曾经引起数以亿计的人死亡,造成人类历史上巨大的灾难。鼠疫是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病,我国鼠疫自然疫源地分布广泛,占国土面积的15%左右,且上世纪90年代以来疫区动物鼠疫流行面积不断扩大,人间鼠疫病例呈上升态势,因此鼠疫的防治对我国经济发展和社会稳定依然具有非常重要的意义。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是革兰氏阴性菌中普遍存在的重要毒力机制,在细菌感染宿主细胞时能向宿主细胞内靶向转运效应蛋白,并抑制和调控宿主的天然免疫响应机制。鼠疫菌的pCD1质粒编码的T3SS是由二十多个蛋白构成的分泌装置,其效应蛋白称为Yops(Yersinia outer membrane protein)。Yops经T3SS被输送到真核细胞内或细胞外间质,通过干扰宿主细胞的天然免疫功能包括抑制宿主机体的炎症反应、抑制非特异性的免疫保护、使菌体免受吞噬细胞的吞噬和杀伤等作用得以存活和增殖,进而建立持续感染。YopK是鼠疫菌效应蛋白之一,研究表明YopK与鼠疫菌的毒力相关,但是其作用机制仍然不明确。在本室前期工作中,利用酵母双杂交技术筛选到鼠疫菌T3SS的效应蛋白YopK与人蛋白MATN2(Matrilin-2)存在相互作用。MATN2是细胞外丝纤维状网络结构的重要组成成分,与胶原蛋白I、胶原蛋白IV、原纤维蛋白-2、纤维连接蛋白等蛋白组成的复合物结合,尚未有研究报道它与微生物致病机制相关。本研究旨在深入研究YopK对鼠疫菌毒力的影响,验证YopK与人蛋白MATN2的相互作用及其对鼠疫菌致病性的贡献,促进我们进一步深入了解鼠疫菌的致病机制。本研究首先利用λ-Red重组系统构建鼠疫菌201株的yopK基因突变株即?yopK,在突变株基础上利用低拷贝质粒pACYC184为载体,构建了yopK基因互补株。经过特异性PCR检测和免疫印记实验结果证实鼠疫菌?yopK和互补株构建成功。我们用鼠疫菌野生株201株和?yopK、互补株感染BALB/c小鼠观察YopK与鼠疫菌毒力之间的关系。LD50结果显示,鼠疫菌?yopK株静脉注射途径攻毒时毒力显著下降(201株LD50=31cfu,?yopK LD50=1380cfu),互补株恢复毒力(LD50=89cfu),而经皮下途径感染时毒力没有显著变化。我们将鼠疫201株和?yopK通过尾静脉注射途径感染BALB/c小鼠,于感染后24,48和72小时取动物的肝脏、脾脏和肺脏,采用脏器研磨、适当稀释后涂平板计数的方法进行脏器的细菌载量测定。结果显示在肝、脾、肺中,鼠疫菌野生株数量显著高于yopK突变株,72小时后?yopK攻击的小鼠已经开始进入感染的恢复阶段,即细菌的载量呈现下降趋势。在同一时间点,不论是野生型鼠疫菌还是yopK菌株,其载量都是在肝脏中最多,其次是脾脏,肺脏中最少。本研究还纯化了YopK蛋白,并制备了YopK蛋白的特异性抗体,用以分析YopK感染宿主细胞后的定位,即YopK能否被转运到宿主细胞内。我们利用细胞裂解组分免疫印记分析的方法检测鼠疫菌野生株和?yopK感染HeLa细胞后YopK蛋白的定位情况。结果显示鼠疫菌野生株感染的细胞培养基上清和细胞裂解后的沉淀中均存在YopK蛋白,但是在HeLa细胞裂解液上清中却不能检测到YopK的条带,说明YopK可以被鼠疫菌的T3SS转运到菌体外从而进入了细胞培养基上清,但是不能转运到宿主细胞中,即YopK主要存在于宿主细胞外。这一结果提示我们,YopK可能在宿主的粘附和入侵阶段发挥其毒性作用。因此,我们继续分析yopK基因突变对HeLa细胞的粘附和抗小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力的影响。我们用感染HeLa细胞作为鼠疫菌粘附宿主上皮的细胞模型,并加入细胞松弛素D抑制细胞内吞作用,用野生菌株和?yopK感染HeLa细胞并用鼠疫菌特异性抗体对鼠疫菌进行荧光标记,然后用流式细胞仪分析HeLa细胞粘附鼠疫菌的情况。结果显示,yopK突变株对HeLa细胞的粘附能力显著下降。用同样的分析手段,我们分析了YopK对鼠疫菌被RAW264.7细胞吞噬的影响。结果显示,?yopK被RAW264.7的吞噬百分比与野生型菌株相比没有明显的变化。这一结果证实了我们的假设,即YopK与鼠疫菌与宿主细胞的粘附相关。鼠疫菌在感染的早期阶段需要粘附并被巨噬细胞吞噬,逃避宿主的免疫监视和清除作用,并在宿主巨噬细胞内大量的繁殖。在胞内繁殖阶段,鼠疫菌的F1抗原、pH6抗原等毒力因子开始大量表达,使鼠疫菌获得了在细胞外生存的能力。因此我们认为YopK可能在鼠疫菌感染的早期阶段发挥重要作用。本研究初步探讨了YopK和MATN2的相互作用与致病机制之间的关系。MATN2是matrilins家族(包括MATN1-4)最大的成员,全长956aa,分子量约10万Da。MATN2前23aa编码信号肽,包含2个类似vWFA的结构域,中间由10个EGF模块连接。我们以人cDNA为模板,构建了MATN2的pCMV-Myc表达载体,及其截短体,并成功的在293细胞中瞬时表达这些蛋白。首先我们通过GST- pull down技术证实了YopK与人蛋白MATN2之间确实存在着体外相互作用。MATN2截短体与MATN2的GST- pull down分析确定MATN2与YopK蛋白结合的部位位于MATN2的574-903位氨基酸,对应于后2个EGF结构域和vWA结构域,而该vWA结构域中存在一个MIDAS (metal ion dependent adhesion site,金属离子依赖的黏附位点)模体,序列为DXSXSXnTXnD。因此,我们构建了MATN2在MIDAS的三个关键氨基酸位点的突变体,GST- pull down分析显示三个突变体与YopK蛋白均存在相互作用,三个位点的突变体不影响YopK与MATN2的结合。我们还将进一步研究YopK和MATN2的相互作用的机制及其生理学意义。本研究结果表明,YopK与鼠疫菌与宿主细胞的粘附密切相关。YopK与MATN2存在相互作用,并且这种相互作用的存在是MATN2的vWA2结构域所介导的。我们还将深入研究YopK蛋白与MATN2的相互作用与YopK影响宿主细胞粘附功能之间是否有联系,为揭示鼠疫菌的致病机制提供分子水平的证据。