目前酶为标靶的分子筛选技术已在国内外广泛应用。酶作为分子标靶开展筛选,现有的方法主要是考察筛选对象对酶活的抑制作用,因此筛选过程往往对酶活要求高。由于价格高,资源少,靶酶的获取目前是这项研究的难题。而资源较多的基因工程克隆酶又存在酶活低的问题,在现有的以酶活性抑制率作为考察指标的方法中,很难应用。如何利用活性低的酶进行筛选,是一个亟待解决的问题。根据目前的研究现状,本实验室已经建立了可用于筛选天然药效物质的前沿亲和色谱筛选平台。本文在此平台的基础上以筛选对象与酶蛋白的分子结合为考察依据,继续依托前沿亲和色谱技术进行,以一级结构完整、但活力较低的酶作为筛选标靶。通过研究酶活对筛选结果的影响,得到在不同酶活条件下的筛选结果,并且验证了此筛选平台在靶酶酶活低但一级结构完整的条件下,依然可以获得有效检测结果。同时还将该方法应用于糖化酶抑制剂的检测,实验证明此方法比传统的糖化酶抑制剂的筛选方法更精确、灵敏度更高。本文的主要研究内容如下:一、研究方法:1、为了研究酶活对筛选结果的影响,将胰蛋白酶进行加热,获得了一级结构不改变而酶活有损失的酶。首先选用酶的特异性底物N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)进行检测。以酶活为2933.33 U/mL和33.33 U/mL的胰蛋白酶分别作为靶酶,以凝胶-溶胶法制得前沿亲和色谱柱,并且比较检测结果,以获得不同酶活对筛选结果的影响。2、前沿亲和色谱应用于胰蛋白酶抑制剂苦参碱、苦参素的筛选已获得本实验室的验证。本文在此基础上,同样以加热的方法得到酶活分别为 2933.33 U/mL、2053.33 U/mL、1353.33 U/mL、1030 U/mL、373.33 U/mL、66.67 U/mL、33.33 U/mL、32.33 U/mL 的酶。以不同酶活的酶作为标靶,对苦参碱、苦参素进行检测,得到了酶活对筛选结果的影响。3、在以上实验建立的分析方法的基础上,以糖化酶作为靶酶,以杨梅黄酮作为检测对象对该前沿亲和色谱筛选方法进行应用。通过改变酶活、酶的纯度、改变制柱条件中PEG的用量和浓度,获得适用于以糖化酶为靶酶的色谱柱的应用条件。二、实验结果:1、BAPNA与酶活为2933.33 U/mL的胰蛋白酶的Kd(0.525 μM)明显小于其与酶活为33.33 U/mL的Kd(1.977 μM)。说明酶活减小,则两者结合度也降低。该结果也从侧面验证酶的特异性底物与酶的结合主要与酶的空间结构有较大的关系。2、实验得到的结果显示,酶活改变的情况下,小分子化合物苦参碱、苦参素与酶的Kd有微小变化。但是仍然可以得到苦参碱与胰蛋白酶的亲和力大于苦参素的结果。这说明酶活对筛选结果无影响,可推测小分子物质与酶的结合很可能是单位点结合,与酶的一级结构相关,受酶的二、三级结构变化影响较小。3、实验结果显示,酶活力明显减小的情况下,杨梅黄酮与酶结合的Kd不会发生明显的变化;酶的纯度提高后,酶的比活力提高,杨梅黄酮与酶结合的Kd明显减小,即两者结合度增加;PEG分子量在一定范围内(400-1000)时,分子量越小,越能获得较好的流出曲线;相同分子量情况下,PEG浓度越大,样品流出曲线的突破体积越大,在150mg/mL-250mg/mL的范围内时,均可以获得有效的检测结果。