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目的:1)通过网络药理学分析肠道菌群代谢产物丁酸钠的药理作用靶点与骨关节炎病理过程中的共有作用基因与相互作用的机制。在体外构建骨关节炎软骨细胞模型并给予最佳剂量的丁酸钠干预探究丁酸钠对软骨细胞自噬的影响及对自噬调节关键蛋白m TOR信号通路的影响;2)进一步探究由丁酸钠诱导的软骨细胞自噬在软骨细胞及OA小鼠的关节软骨分解代谢、炎症反应、凋亡、活性氧、细胞周期及m TOR信号通路的影响;3)通过体内构建骨关节炎小鼠模型并给予不同剂量丁酸钠干预探究丁酸钠对骨关节炎软骨及软骨下骨中细胞自噬和m TOR信号通路的影响。方法:1)分离培养及鉴定C57BL/6J原代软骨细胞。通过CCK-8评估丁酸钠对正常的和IL-1β干预的软骨细胞活性影响。通过免疫印迹、免疫荧光和透射电镜观察丁酸钠对体外OA模型中软骨细胞自噬的影响。通过Western Blot和免疫组织化学染色评估丁酸钠对m TOR信号通路的影响;2)通过蛋白印迹、细胞流式、免疫荧光、免疫组织化学染色探索丁酸钠对IL-1β诱导的软骨细胞基质代谢、炎症、凋亡、活性氧损伤和细胞周期阻滞的影响;3)预实验设立6组,即假手术组,ACLT+安慰剂组,ACLT+浓度梯度的口服丁酸钠治疗组。术后60天评估软骨退变情况以确定最佳的用药剂量。后续的正式试验中设立3组,即假手术组,造模组和丁酸钠口服灌胃治疗组。通过HE和番红固绿染色评估关节软骨钙化和蛋白聚糖的情况,采用小鼠骨关节炎软骨组织评分评估软骨的退变程度。通过免疫组化分析小鼠关节软骨细胞外基质代谢和凋亡的特征性指标。通过免疫组织化学分析测定关节软骨自噬特征性指标LC3、Beclin1和p62的表达;4)通过Micro-CT分析丁酸钠对软骨下骨微观结构的改变;5)通过Micro-CT血管造影分析丁酸钠对软骨下骨血管增生的影响。免疫组织化学染色测定血管生成相关因子的表达水平。结果:1)形态学观察软骨细胞呈现出长梭形,阿力新蓝染色和免疫荧光都显示出特征性表达Collagen II,选取分离培养第二代后的软骨细胞进行实验。CCK-8结果显示,500μM以上浓度的丁酸钠对软骨细胞有毒性作用,250μM浓度的丁酸钠对IL-1β干预的软骨细胞的活性提升作用最显著。网络药理学结合生信分析结果显示丁酸钠靶向基因主要与生长因子、细胞存活以及免疫或炎症反应有关。丁酸钠靶向作用基因分别是AKT1、TP53、PTEN、GSK3B、MDM2、CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、FOXO3、m TOR和CDK4。Western blotting、免疫荧光和透射电镜显示丁酸钠可有效激活并促进软骨细胞自噬并恢复受阻的自噬流;丁酸钠对软骨细胞自噬的增强作用主要是通过靶向调控PI3K/AKT/m TOR和MAPK/m TOR信号通路对m TOR抑制而产生的;2)丁酸钠通过促进软骨细胞的自噬而发挥抑制分解代谢与炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2、Collagen II、aggrecan、MMP3、ADAMTS-5)和促凋亡因子(Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2)的表达。细胞流式分析显示丁酸钠可通过激活软骨细胞自噬而抑制由IL-1β诱导的软骨细胞异常活性氧生成和DNA损伤与细胞周期阻滞;3)体内构建OA模型探究丁酸钠的最佳剂量为150mg/kg。正式实验结果显示丁酸钠可抑制实验性OA关节软骨的退变。丁酸钠可促进软骨保护指标的表达(Collagen II),抑制分解代谢指标(MMP3)。同时可抑制炎症因子的产生和软骨细胞凋亡指标的异常表达。实验性OA模型中,丁酸钠治疗同样可激活并促进软骨细胞自噬恢复通畅的自噬流;4)Micro-CT检测提示丁酸钠可有效抑制骨关节炎软骨下异常的骨吸收及骨囊肿的形成;5)Micro-CT显微血管造影成像技术显示丁酸钠可有效抑制软骨下骨异常增生的血管数量与机体。结论:1)丁酸钠通过抑制m TOR信号通路在病理状态下的磷酸化而激活并促进软骨细胞自噬;2)丁酸钠可通过增强软骨细胞的自噬作用而抑制骨关节炎软骨细胞的分解代谢、炎症反应和凋亡;3)丁酸钠可通过增强软骨细胞自噬减少ROS和缓解DNA损伤而引起的软骨细胞周期阻滞;4)丁酸钠在OA小鼠模型中可保护软骨的完整性并促进蛋白多糖的合成。抑制软骨下骨的破骨细胞的异常激活,维持软骨下骨成骨与破骨细胞正常的耦联机制;5)丁酸钠通过抑制血管生成因子的表达抑制软骨下骨血管的异常增生,从延缓骨关节炎进展。