研究背景与目的婴幼儿血管瘤（infantile hemangioma,IH）是婴幼儿期最常见的软组织肿瘤,且发病率在过去30年呈稳定增长趋势,约3-5%。尽管大部分血管瘤呈早期快速增生随之逐渐消退的自限性病程,但是处于快速增生期以及位于重要部位的血管瘤仍可导致破溃、出血、外观及功能损害等严重并发症,甚至危及生命。增生期婴幼儿血管瘤的典型病理表现包括致密的内皮细胞团及壁厚微血管结构,并逐渐被纤维脂肪结构所替代。婴幼儿血管瘤的发病机制目前尚不明确,可能受组织缺氧、发育缺陷等外源性因素以及血管生成因子（VEGF）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）等内源性因素的共同调控。既往研究发现非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,如长链非编码 RNA（Longnon-coding RNA,LncRNA）、微小 RNA（microRNA,miRNA）,在婴幼儿血管瘤的疾病进程中至关重要,一些miRNA还可作为婴幼儿血管瘤的潜在诊断标志物及预后指标。环状 RNA（circular RNA,circRNA）是一种新型 ncRNA,是由前体 mRNA选择性剪接形成的闭合环形分子。近几年,借助于高通量测序技术的迅速发展,之前被误认为是“剪接错误”的circR]NA被大量发现,目前已经成为ncRNA研究领域的重点。国内外学者发现circRNA在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病中均存在显著差异表达,并且可通过多种作用机制影响疾病进程。CircRNA所具有的高丰度、高稳定性、序列保守性及组织、细胞特异性等特征,提示其在疾病的发生、发展中具有重要的调控作用。基于当前研究,CircRNA的作用机制主要包括以下4个方面:通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）机制或miRNA海绵作用,抑制miRNA活性,进而调控相关mRNA表达;竞争线性剪接或调控转录,影响亲本基因表达;与RNA结合蛋白（RBP）等重要蛋白相互作用以调控基因表达;最近研究发现部分circRNA还具有翻译功能。CircRNA在肿瘤发生以及血管性疾病等相关领域中的重要作用提示其在婴幼儿血管瘤的发生、发展中可能也具有重要的调控作用。目前circRNA在婴幼儿血管瘤中的表达及功能尚无相关研究。明确circRNA在增生期婴幼儿血管瘤中的表达,分析并探索其可能的功能及调控机制,有助于完善ncRNA在婴幼儿血管瘤中的调控网络。研究方法1.标本收集:根据严格的纳入及排除标准,收集2015年6月到2017年5月的增生期血管瘤标本及瘤旁皮肤组织共10对,PBS洗净后置于RNALater中4°C过夜,转至-20℃保存,用于芯片检测及PCR验证;留置部分标本采用4%多聚甲醛固定,用于病理检测。采用HE染色及GLUT1、CD31免疫组化染色验证增生期婴幼儿血管瘤的诊断及病理特征。2.CircRNA 芯片检测及数据分析:采用 Arraystar Human circRNA V2 Array检测4对增生期婴幼儿血管瘤标本及瘤旁组织circRNA表达谱。采用Trizol法分离提取总RNA,采用紫外线检测法确定RNA样品纯度及浓度,通过变性琼脂糖凝胶电泳检测样品完整度。采用Rnase R消化除去线性RNA并富集circRNA。利用随机引物法扩增富集的circRNA并转录成荧光cRNA。将标记的cRNA杂交到 Arraystar Human circRNA V2 Array（8x15K,Arraystar）上。芯片采用 Agilent Scanner G2505C扫描。Agilent Feature Extraction软件用于分析芯片图像。R语言limma包进行数据处理。经t-检验差异倍数≥2.0且P<0.05视为有统计学差异。绘制火山图、散点图及聚类图显示差异表达的circRNA。3.qRT-PCR法验证:采用实时荧光定量PCR技术对circRNA在10对增生期婴幼儿血管瘤中的表达进行验证,选择6个显著差异表达的circRNA（cricRNA₁ 00933,circRNA₁00709,circRNA₁02116,circRNA₀51239,circRNA₁02039,circRNA₁04310）进行检测。采用 Primer 5.0 设计 circRNA 特异性背靠背引物。采用β-actin作为内参基因。4.CircRNA功能分析:采用多种生物信息学技术分析差异表达的circRNA的潜在功能。通过MRE靶标预测软件（基于TargetScan&miRanda）分析circRNA/miRNA相互作用。采用miRWalk2.0预测miRNA下游靶基因,并结合增生期婴幼儿血管瘤mRNA表达谱数据,利用Cytoscape构建circRNA/miRNA/mRNA调控网络。基于DAVID以及KOBAS 3.0在线工具,采用GO和KEGG通路富集分析分别探索circRNA的亲本基因以及其间接介导的circRNA/miRNA/mRNA调控网络的潜在功能。5.初步功能验证:选择显著上调的circRNA₁00933作为目标circRNA,构建两种RNAi慢病毒载体并转染脐静脉内皮细胞;采用MTT法、克隆形成试验及FACS法检测circRNA₁00933对细胞增殖及凋亡的影响;采用双荧光素酶报告基因试验验证circRNA-100933与miR-137的结合位点;采用qRT-PCR法检测circRNA₁00933对miR-137的调控以及miR-137在增生期婴幼儿血管瘤中的表达。采用 qRT-PCR 及 western blot 检测 circRNA₁00933 对 VEGFA 表达的影响。研究结果1.增生期婴幼儿血管瘤的病理学特征:组织标本GLUT1、CD31免疫组化染色呈阳性,婴幼儿血管瘤诊断明确;HE染色显示增生期婴幼儿血管瘤以大量增生的内皮细胞团及紊乱的微血管结构为主。2.增生期婴幼儿血管瘤circRNA表达谱鉴定:各样本RNA质量检测合格,且cRNA标记效率符合要求。聚类图显示circRNA在血管瘤与瘤旁组织中存在显著差异表达,通过散点图及火山图共发现234个上调和374个下调的circRNA（FC≥2.0,P<0.05）。其中外显子型circRna占据最大比例,内含子型circRNA次之。除chrY,各染色体中均有circRNA定位。3.差异表达的circRNA的qRT-PCR检测结果:我们选择了 6个显著差异表达的circRNA进行验证。其中cricRNA-100933,circRNA₁00709在婴幼儿血管瘤中显著上调,circRNA-104310在婴幼儿血管瘤中显著下调,与芯片表达趋势一致,且差异具有统计学意义。另外三个circRNA（circRNA-102116,circRNA₀51239,circRNA-102039）的变化趋势与芯片结果变化方向一致,但缺乏统计学意义。4.差异表达的circRNA功能分析:采用MRE靶标预测软件对circRNA的miRNA结合位点进行预测,共发现1248个可能结合的miRNA,借助Cytoscape构建circRNA/miRNA网络。结合文献发现其中一些miRNA在婴幼儿血管瘤中具有重要的调控作用。此外,通过对差异表达的circRNA的亲本基因进行GO和KEGG通路富集分析,发现其与肿瘤发生、血管发育相关功能及信号通路密切相关。最后,选择显著上调的circRNA₁00933及显著下调的circRNA₁04310进行 circRNA/miRNA/mRNA 网络构建。circRNA₁00933 的 MRE 包括 miR-137,miR-1298-3p,miR-892b,miR-2113,miR-514a-5p;而 circRNA₁04310 的 MRE 包括 miR-499a-3p,miR-1271-3p,miR-216a-3p,miR-197-3p,miR-489-3p。通过整合miRNA靶基因预测数据及增生期婴幼儿血管瘤mRNA表达谱数据,分别获得circRNA₁00933间接介导的100个靶基因以及circRNA₁04310间接介导的94个靶基因。GO和KEGG通路富集分析显示circRNA₁00933介导网络主要富集在上皮细胞迁移、血管发育等生物过程,以及VEGF信号通路、Rap1信号通路等。circRNA₁04310介导网络则主要富集在细胞脂代谢、细胞内信号传导等生物过程以及HIF-1α通路等重要信号通路。5.CircRNA₁00933初步功能研究:选择显著上调的circRNA₁00933进行初步功能研究发现,敲减circRNA₁00933可明显抑制细胞增殖,并促进凋亡。生物信息学分析发现circRNA₁00933与重要的抑癌因子miR-137序列互补具有结合位点。PCR检测示miR-137在婴幼儿血管瘤中显著下调。采用双荧光素酶报告基因试验证实circRNA₁00933可通过预测位点结合miR-137。在细胞中敲减circRNA₁00933可显著上调miR-137表达,提示circRNA₁00933可能具有miR-137海绵作用。VEGFA是婴幼儿血管瘤中的重要调控因子。PCR检测示VEGFA在婴幼儿血管瘤中显著上调。在细胞中敲减circRNA₁00933可显著下调VEGFA的mRNA及蛋白水平,提示circRNA₁00933可能正向调控VEGFA表达。结论1.本研究采用芯片检测技术首次鉴定了 circRNA在增生期婴幼儿血管瘤及瘤旁组织中的表达,发现了大量差异表达的circRNA并采用qRT-PCR对6个差异表达的circRNA进行了验证。大量circRNA在婴幼儿血管瘤中的显著差异表达提示其可能在婴幼儿血管瘤的发生、发展中具有重要作用。2.基于芯片检测结果,采用多种生物信息学分析手段对差异表达的circRNA进行功能分析。采用MRE靶标预测软件发现大量与circRNA具有互补结合位点的miRNA,并构建circRNA/miRNA互作网络;采用GO分析及KEGG通路富集分析发现circRNA的亲本基因参与多条肿瘤发生、血管发育相关的重要通路。以上两方面结果共同提示circRNA可能通过不同作用机制在婴幼儿血管瘤中发挥重要作用,本研究在后续实验中初步探索了目标circRNA的miRNA海绵作用,关于差异表达的circRNA是否可通过竞争线性剪切或结合重要蛋白而影响亲本基因的表达仍有待未来进一步验证。3.结合miRNA靶基因预测数据及婴幼儿血管瘤mRNA表达谱构建了circRNA₁00933/miRNA/mRNA 和 circRNA₁04310/miRNA/mRNA 网络。采用GO分析及KEGG通路富集分析发现两个互作网络均富集于多条与婴幼儿血管瘤密切相关的重要通路。4.基于PCR验证及生物信息学分析结果,我们首次对显著上调的circRNA₁00933在细胞中的功能及miRNA海绵作用进行初步探索。结果发现敲减circRNA₁00933可显著抑制细胞增殖,促进凋亡,并抑制重要因子VEGFA表达,提示其在婴幼儿血管瘤中可能起着促瘤作用。此外,circRNA₁00933还可通过互补位点结合miR-137并调控其表达,提示circRNA₁00933可能通过miR-137海绵机制发挥作用。初步实验结果提示circRNA₁00933在婴幼儿血管瘤中具有重要的研究价值,下一步仍需要进行更为深入的体外及体内实验进行验证。