红参（Red ginseng）是当前较为常见的人参熟制品,性温,微苦,具有补元气、安神明目、益气摄血之功效,与鲜人参相比,其温补效果更为突出,药效更为强劲。在加工过程中形成的梅拉德反应（Maillard reaction,MR）是导致化学成分复杂、颜色变红以及产生香气的重要原因,也是使红参药性改变、药用价值更加丰富的主要因素之一。红参加工过程中产生的氨基酸衍生物是MR重要的初级产物,是由氨基酸和还原糖发生羟醛缩合反应,经Amadori重排后而形成的一类化合物。因此,明确人参加工炮制过程中氨基酸和还原糖类成分的含量变化,深入探究红参加工过程中氨基酸衍生物的产生机理,利用MR原理,将其进行模拟合成,为实现工业化生产奠定基础。同时,基于前期研究,深入探究其药用价值,对于揭示红参梅拉德反应产物（Maillard reaction products,MRPs）的化学组成和生物活性具有重要意义。本研究通过人参加工炮制过程中氨基酸和还原糖的含量变化,较为系统地探究了人参加工炮制过程中蒸制方式和加热温度对MR进程的影响,明确红参中氨基酸衍生物的产生机理,并基于单因素实验和Box-Behnken设计,利用响应曲面法进行模拟合成工艺优化,为其工业化生产奠定基础。此外,本课题组前期研究表明红参及其有效成分可通过调控MAPK信号通路抑制细胞凋亡和自噬对Cisplatin致小鼠肠道损伤具有保护作用;而且前期体外研究也表明红参中AFG对Cisplatin致大鼠小肠隐窝上皮细胞（rat intestinal crypt epithelial,IEC-6）损伤具有较好地保护作用,揭示了红参及其有效成分在治疗肠道损伤的应用潜力。为进一步探究红参中氨基酸衍生物的肠道保护活性,本研究还通过体内外实验相结合的方法,从肠道机械屏障、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等方面,较为深入地揭示了红参中氨基酸衍生物的肠道保护活性及其发挥药效的分子机制,进一步挖掘红参中氨基酸衍生物的药用价值,并为临床探究肠道保护方案提供潜在的治疗靶点。其主要研究内容如下:1.HPLC法分析人参不同炮制品中氨基酸和还原糖的含量变化本研究利用HPLC法探究了同一批鲜参加工的生晒参、大力参、活性参、红参和黑参五种人参炮制品中氨基酸和还原糖类成分的含量变化,明确加工温度和蒸制方式对其成分和含量的影响。结果表明:人参中含有精氨酸（Argnine,Arg）、丙氨酸（Alanine,Ala）、天冬氨酸（Aspartic acid,Asp）和谷氨酸（Glutamic acid,Glu）等17种氨基酸类成分,以生晒参中的Arg（16.478 mg/g）含量最高,但在加工过程中,Arg、组氨酸（Histidine,His）和赖氨酸（Lysine,Lys）组成的碱性氨基酸（Basic amino acid,BAA）变化最为明显,下降至生晒参的50.2%左右,而酸性氨基酸（Acidic amino acid,AAA）下降30.4%（红参）,其总氨基酸（Total amino acids,TAA）含量由高到低的顺序是活性参＞生晒参＞大力参＞红参＞黑参。此外,利用UV/HPLC法系统探究了人参加工炮制过程中的糖类变化,结果表明:上述炮制品中多糖含量的顺序依次为生晒参＞大力参＞红参＞黑参＞活性参,而还原糖组成分析发现,五种人参炮制品中含有鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等还原糖,其含量在炮制过程也会发生不同程度的改变。基于以上结论可知,经加工温度或蒸制方式会使氨基酸和还原糖含量变化较为明显,为后续揭示MR的产生提供理论依据。2.人参炮制过程中水溶性褐变物的产生及其化学成分的初步研究在明确人参炮制过程中氨基酸和还原糖的含量变化基础上,根据五种人参炮制品较为直观的色度和褐变度探究不同炮制品褐变度与加工方式之间的关系,并明确水溶性褐变物的产生。结果表明:活性参基本无明显的褐变,而其余炮制品的褐变度依次是大力参（1.020）＜生晒参（1.082）＜红参（1.412）＜黑参（3.907）。随着加工方式的不同,不同人参炮制品的L*值逐渐减少,a*值和b*逐渐增大,而活性参、生晒参和大力参之间的L*、a*和b*值则差异较小。揭示了人参在加工炮制过程中,蒸制方式和烘干温度等条件的改变会增加MR的积累量,表明当红参在蒸制时间3h,烘干温度60℃时,水溶性褐变度的色度值和褐变度趋于稳定。此外,本章还利用LC/MS技术分析了水溶性褐变物的主要成分,发现其共有成分包含氨基酸、Panaxacycloalkynol和部分还原糖,也从红参中发现了氨基酸衍生物的存在,为后续研究奠定基础。3.红参中氨基酸衍生物的分析及模拟合成工艺优化基于上一章研究,本章通过ESI-MS对红参中的氨基酸衍生物进行深入探究,结果表明:红参中含有m/z 377.0863、426.1654、431.1413和497.2096分子量的化合物,依据梅拉德初级产物分析,明确了红参中AFG和丙氨酸衍生物的存在。通过模拟合成的方法进行化学合成,并基于单因素实验和Box-Behnken设计,利用响应曲面法对红参中氨基酸衍生物的合成进行工艺优化,并以HPLC-ELSD手段分析其合成率,最终确定丙氨酸衍生物最佳合成工艺为:以冰醋酸为反应媒介,反应温度为85℃,反应120 min,料液比为1:3时合成率达到74.12%;精氨酸与麦芽糖合成的AFG工艺参数为:以冰醋酸为反应媒介,温度控制在85℃,反应时间为120 min,反应物质料液比为1:4,合成率达83.70%。本章揭示了红参加工过程中氨基酸衍生物的产生,为红参MR初级产物的工业化生产奠定基础,也为MRPs的应用和活性开发提供物质基础。4.精氨酸乳糖苷（Argininyl-fructosyl-galactose,AFGA）的合成、分离纯化与结构鉴定本章在明确红参中氨基酸衍生物产生机理的基础上,将麦芽糖的差向异构体——乳糖与精氨酸相结合,通过模拟合成,再利用反复硅胶柱层析和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P-II）柱层析等分离手段,对合成物进行分离纯化,采用HPLC-ELSD分析确定产物纯度为99.94%,冻干后得到白色粉末。该化合物易溶于水、甲醇、乙醇等,熔点（mp）为158～160℃,TLC分析茚三酮显色反应为紫红色,高分辨质谱确定其分子量为497.3612（负离子模式）,核磁共振(~1H,13C,HMBC和HSQC)进行结构鉴定,确定其结构为1-（精氨酸-Nα基）-1-去氧-4-O-（α-D-吡喃半乳糖基）-D-果糖,将其命名为精氨酸乳糖苷（Argininyl-fructosyl-galactose,AFGA）。本章依据红参加工过程MR的产生原理,进一步丰富了红参中MRPs的化学组成,并扩大其应用范围,为MR在人参炮制品方面的深入应用提供理论基础和物质参考。5.AFG调控NF-κB/Caspase信号通路改善Cisplatin致小鼠肠道损伤建立Cisplatin致小鼠肠道损伤模型,探究AFG对Cisplatin致小鼠肠损伤的改善作用及可能的分子机制。结果表明:AFG（40和80mg/kg）能有效改善Cisplatin导致的肠黏膜损伤,并能增强紧密连接蛋白ZO-1/occludin蛋白的表达水平（p＜0.01）,从而提高肠道黏膜的屏障功能。同时,通过测定基本生化指标、Hoechst 33258染色、免疫荧光染色和Western blot等药理学手段。结果表明:AFG可通过改善肠道黏膜屏障功能、恢复肠道内源性抗氧化防御系统、减轻炎症反应及抑制细胞凋亡等途径而发挥保护活性。该结果充分佐证了前期体外的研究结果,并深入揭示其发挥药效的分子机制可能与调控ZO-1/Occludin及NF-κB/Caspase途径有关,为系统探究Cisplatin致肠道损伤的分子机制提供新的思路。6.AFGA安全性评价及其对Cisplatin致肠道损伤的保护活性研究AFGA是本研究应用红参MR形成机理,创新性地合成出一种新型氨基酸衍生物。本章先通过ICR小鼠灌胃方式分别一次性给予AFGA（0.5 g/kg,1.0 g/kg,3.0 g/kg和6.0 g/kg）四个剂量,进行AFGA的安全性评价。连续观察7天,期间各组小鼠生命状况良好,未出现小鼠死亡状况,表明AFGA毒性很低,具有较高的安全性,可用于后续活性试验。随后基于活性筛选,确定了红参中氨基酸衍生物的活性差异,明确AFGA的药效学作用,通过建立Cisplatin致IEC-6细胞实验以及小鼠肠道损伤模型,通过体内外相结合的方法,探究AFGA（100 mg/kg）的肠道保护活性及其毒副作用。结果表明,AFGA可通过减少机体ROS的聚集,改善氧化应激（MDA、GSH、CAT、SOD）等作用（p＜0.01）,并能有效减少促炎因子TNF-α和IL-1β的分泌以及NF-κB蛋白表达水平发挥抗炎活性（p＜0.01）。同时,还能有效抑制ROS介导的细胞凋亡发生,Hoechst 33258染色以及Western blot分析了AFGA能显著降低Cisplatin诱导细胞凋亡的发生,抑制小鼠肠道组织中caspase 3、9、cytochrome C和Bax蛋白表达（p＜0.01）,促进Bcl-2蛋白表达（p＜0.01）,揭示了PI3K/Akt信号通路可能是AFGA防治Cisplatin致肠道毒性的潜在靶点。