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东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种寄生于水牛红细胞内,由镰形扇头蜱经卵传播的血液原虫,只引起水牛巴贝斯虫病。该病主要分布在中国长江以南,主要临床症状为发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿,严重时导致死亡,给我国水牛养殖业带来了巨大损失。尽管对东方巴贝斯虫的体外培养、形态学、传播媒介、分子分类学和诊断方法等有了一定的认识,但对其入侵机制还不了解,缺乏有效的抗原用于免疫诊断和预防。本研究在建立了东方巴贝斯虫cDNA文库的基础上,通过免疫筛选挑选3个可能与免疫相关的基因,对其进行生物信息学分析,原核或真核表达及免疫原性研究。(1)B. orientalis cDNA文库的免疫筛选用东方巴贝斯虫阳性的水牛血清对东方巴贝斯虫裂殖子cDNA文库进行免疫筛选,挑选其中3个可能与免疫相关的基因：BoP34、BoP21和AMA1,对其进行克隆测序和生物信息学分析。BoP34基因的核苷酸序列全长为1088bp,包含两个开放阅读框(ORF),编码251个氨基酸,蛋白分子量约为34kDa。BLAST分析表明,BoP34与牛巴贝斯虫核移动蛋白(XM001611335)核苷酸序列的相似性为72%,证明其为东方巴贝斯虫的核动蛋白基因。BoP21基因的核苷酸序列全长为732bp,包含一个579bp的ORF,编码192个氨基酸,蛋白分子量约为21kDa。BLAST分析表明,BoP21与牛巴贝斯虫假定蛋白(BAN64167.1)核苷酸序列的相似性为68%,证明其为东方巴贝斯虫的假定蛋白基因。东方巴贝斯虫AMA1基因的核苷酸序列全长为1803bp,没有内含子,编码600个氨基酸,蛋白分子量约为67kDa。同源性分析表明,该基因与牛巴贝斯虫(GenBank序列号：XP001611043)、双芽巴贝斯虫(GenBank序列号：ADP02977)、吉氏巴贝斯虫(GenBank序列号：ABD04040) AMA1核苷酸序列的相似性分别为72%、52%和53%。结构分析表明,它具有AMA1基因家族的氨基酸结构特征,如N端信号肽,形成二硫键的半胱氨酸残基,含有三个结构域的胞外域,C端跨膜区及胞质尾域。(2)BoP34、BoP21和AMAl基因的克隆、原核表达及免疫反应原性根据BoP34、BoP21和AMAl基因的全长测序结果,分别设计特异性引物克隆BoP34-ORF2、BoP-ORF和AMA1的结构域Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ,构建原核表达质粒pET-32a-BoP34-ORF2. pET-28a-BoP21-ORF和pET-28a-AMA1-DI/II/III,在E.coliBL21中实现了高效表达。将纯化后的BoP34、BoP21和AMA1蛋白分别免疫日本大耳白兔,制备了抗东方巴贝斯虫BoP34、BoP21或AMA1的多克隆抗体。ELISA结果表明,制备的BoP34、BoP21和AMA1多克隆抗体效价分别为100×27,100×27和100×28；Western blot结果显示,BoP34、BoP21和AMA1重组蛋白均可被东方巴贝斯虫阳性的水牛血清所识别,表明此3种蛋白均具有良好的免疫反应原性。分别用BoP34、BoP21和AMA1的多抗血清免疫印迹东方巴贝斯虫总蛋白,均看到与目的蛋白大小一致的特异性条带,表明此3种蛋白均存在于东方巴贝斯虫中。(3)AMA1截短片段的真核表达根据AMA1蛋白二硫键的位置,将AMA1胞外域划分为3个结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,分别克隆结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ/Ⅲ和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ,插入Flag标签后将其连接真核表达载体pT8,通过脂质体转染COS-1细胞,48h后通过间接免疫荧光检测到所有质粒均表达在细胞表面。本研究通过筛选东方巴贝斯虫cDNA文库,挑选3个免疫相关的基因——BoP34、BoP21和AMA1。对它们进行了克隆表达,生物信息学分析,制备了各自的多克隆抗体,并验证了它们均具有良好的抗原性,且在东方巴贝斯虫中有较高量的表达。这些研究为进一步深入探索BoP34、BoP21和AMA1在东方巴贝斯虫中的功能奠定了基础。