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生物柴油是一种可替代传统化石燃料的可再生能源。微藻具有生长周期短、含油量高、不占用耕地等优点,是制备生物柴油的最佳原料,因此引起越来越多的关注。提高油脂产量是降低生物柴油成本的关键,可通过提高微藻生物量和胞内油脂含量两个角度寻求解决方案。氮饥饿是最常用的刺激微藻细胞累积油脂的手段,然而氮饥饿条件下会影响微藻细胞生长,引起生物量降低,从而导致油脂产量增加不明显甚至降低。本文针对这一问题,探究了微藻培养过程中,同时提高生物量和油脂含量的新型微藻培养方案。(1)利用氮限制磷过量条件异养培养微藻。在氮磷浓度正常条件(对照组)培养时,生物量为4.73 g/L,氮限制条件下,生物量仅有2.34 g/L,在氮限制条件下,增加磷浓度至45 mg/L,生物量可达到4.53 g/L,与对照组接近。过量的磷以聚磷的形式储存在细胞内,可为微藻细胞生长和油脂合成提供必要的物质和能量。通过分析生长相关基因表达发现,油菜素类固醇的合成、碳和氨基酸的代谢在微藻细胞生长过程中具有重要作用。氮限制磷过量培养条件下,微藻细胞的油脂含量可达42.3%,油脂产率为310.0 mg/(L·d),分别为氮磷正常培养条件下的2倍和1.32倍。油脂组分分析得出C16和C18的脂肪酸比例高达95%以上,并且,饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的比例均高于对照组。因此,氮限制磷过量策略培养微藻不仅可以提高生物量、油脂含量,而且可以提升生物柴油的品质。(2)氮限制磷过量培养条件下磷的投加方式对微藻生长和油脂合成的影响。氮限制磷过量培养条件下,增加磷的投加次数对微藻的生长有一定抑制作用,分2次投加的最大生物量为3.95 g/L,而分8次投加的生物量为3.53 g/L。增加磷的投加次数可提高微藻细胞的内油脂含量,分8次投加的油脂含量可达到41.5%,与2次投加相比提高了1.2倍。通过分析与油脂合成相关基因表达发现,编码ACCase的基因Unigene7398,编码DGAT的基因CL2735.Contig2、CL73.Contig8、CL12.Contig1、Unigene7590、CL2735.Contig1、Unigene1920,增加磷的投加次数有利于提高油脂合成基因的表达水平。在培养周期末期,不同磷的投加方式对微藻细胞内磷的贮存形态没有显著影响,过量的磷主要以正磷酸单酯的形式存在。此外,分多次投加磷有利于细胞内快速累积以C16:0为主的饱和脂肪酸,而投加次数少有利于C18:0和C18:1两种脂肪酸的累积。因此,增加磷的投加次数对油脂产量的增加没有明显的促进作用,但可以提高细胞内的油脂含量。