【摘 要】
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喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,90%以上为声门癌,其治疗方法以手术为主,因为声带全部或部分被切除,造成喉癌患者术后不能发声或发声受损,严重影响患者的生活质量。热疗被认为是继手术、放疗、化疗和生物疗法后的第5种肿瘤治疗方法。近年来,热疗中的金纳米颗粒光热治疗癌症的方法得到了广泛的关注,其原理是利用金纳米颗粒在可穿透人体而无损伤的近红外激光的照射下,其表面能够发生等离子体共振,吸收光能并最终以大量热能的
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喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,90%以上为声门癌,其治疗方法以手术为主,因为声带全部或部分被切除,造成喉癌患者术后不能发声或发声受损,严重影响患者的生活质量。热疗被认为是继手术、放疗、化疗和生物疗法后的第5种肿瘤治疗方法。近年来,热疗中的金纳米颗粒光热治疗癌症的方法得到了广泛的关注,其原理是利用金纳米颗粒在可穿透人体而无损伤的近红外激光的照射下,其表面能够发生等离子体共振,吸收光能并最终以大量热能的方式有效地传递给环境细胞,产生热杀伤效应。而肿瘤细胞的热耐受差,瘤体散热慢,从而被杀伤而达到治疗目的。研究表明,金纳米颗粒易修饰,可以和抗EGFR抗体结合而贴附于鳞癌和腺癌细胞膜表面,基于上述条件,设计出金纳米链和抗EGFR抗体结合,近红外照射人喉癌Hep-2细胞的靶向治疗计划。目的：评价金纳米链及anti-EGFR/Au共轭物近红外热疗对人喉癌Hep-2细胞的生长抑制和热杀伤作用,以及对裸鼠动物模型的试验治疗作用,并探索其热杀伤导致的凋亡通路信号传导机制。方法：（1）体外实验：首先通过MTT方法检测金纳米链及anti-EGFR/Au有无细胞毒性,并通过电镜观察金纳米链贴附Hep-2细胞跨膜入胞出胞现象；然后用MTT方法检测在不同功率的近红外激光照射下,金纳米链和anti-EGFR/Au对Hep-2细胞生长抑制的程度；光镜下观察癌细胞形态变化；电镜下观察癌细胞凋亡情况；FCM检测癌细胞凋亡率；Westen blot方法检测热疗后Hep-2细胞的凋亡因子bcl-2、bax、caspase-3及Hsp70的表达情况,探讨金纳米链热杀伤肿瘤细胞的可能凋亡通路。比较组间差别,P<0.05为有统计学意义。（2）建立喉癌裸鼠动物模型,动物分组,瘤体分别注射金纳米链和anti-EGFR/Au共轭物,近红外激光照射后观察裸鼠的生长情况、体重变化,绘制肿瘤的生长曲线,计算抑瘤率；动物处死后通过免疫组化方法检测肿瘤组织中bcl-2、bax、及Hsp70的表达,进一步探讨其热疗机制。比较组间差别,P<0.05为有统计学意义。结果：1.通过光谱图的演变观察,金纳米链能够与抗EGFR抗体特异性结合；体外毒性实验表明,葡萄糖体系合成的金纳米链对Hep-2细胞没有毒性；50%浓度是最适合体外实验的浓度；金纳米链在与Hep-2细胞共培养8小时后即能进入细胞,48小时后大部分出胞,能够自由进出细胞。2.体外实验表明,在8w/cm2的激光功率,照射6分钟的情况下金纳米链热疗组和anti-EGFR/Au热疗组的Hep-2细胞就会有大量的凋亡,倒置显微镜下观察可见细胞膜出现发泡现象,细胞贴壁减少,连接稀疏等损伤现象；电镜下观察可见凋亡小体形成,线粒体肿胀等凋亡现象；单纯照射组损伤较轻,在相同的作用条件下,FCM方法检测显示：单纯照射组凋亡率为9.5%,金纳米链热疗组和anti-EGFR/Au热疗组细胞的凋亡率分别达72.0%和95.7%,两者之间有统计学差异（P<0.05）,并且随着照射时间的延长,有凋亡程度加重的梯度变化。3.体外实验表明,Westen blot方法检测金纳米链热疗组和anti-EGFR/Au热疗组的凋亡基因蛋白bcl-2表达均明显减少,bax基因蛋白的表达均明显增加,单纯照射组无明显变化,Westen blot方法检测金纳米链热疗组和anti-EGFR/Au热疗组的Hsp70蛋白表达均显著增高,荧光酶标方法检测金纳米链热疗组和anti-EGFR/Au热疗组的凋亡执行分子caspase-3表达均显著升高,与空白对照组及单纯照射组相比有统计学意义（P<0.05）。4.裸鼠体内实验研究表明,金纳米链热疗组与anti-EGFR/Au热疗组的肿瘤抑瘤率可达43%和52%,而单纯照射组仅为15%。瘤体组织的免疫组化结果显示,金纳米链热疗组和anti-EGFR/Au热疗组的bax及Hsp70均显著高表达,bcl-2均显著低表达,与空白对照组及单纯照射组相比较均有统计学意义（P<0.05）。结论：1.体外实验表明,金纳米链近红外热疗能够对Hep-2细胞有杀伤作用,anti-EGFR/Au比之有更强的杀伤作用。2.裸鼠体内实验表明,金纳米链及anti-EGFR/Au近红外热疗均有明显的抑瘤作用。3.金纳米链近红外热疗杀伤Hep-2细胞的机制可能是通过凋亡因子bcl-2和bax介导的线粒体途径完成。
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