【摘 要】
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基因治疗是将外源核酸分子引入靶细胞,以纠正因基因表达缺陷和异常导致的疾病。将外源基因有效递送至靶细胞并成功表达是基因治疗取得成功的关键。目前,临床上常用的递送载体分为两类:病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体因其较高的转染效率备受人们关注,但其制备过程复杂,可携带的外源基因有大小限制,且具有免疫原性,这些问题限制了病毒类载体的临床应用。大多数非病毒类载体在生理条件下带正电荷,如阳离子聚合物和阳离子
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基因治疗是将外源核酸分子引入靶细胞,以纠正因基因表达缺陷和异常导致的疾病。将外源基因有效递送至靶细胞并成功表达是基因治疗取得成功的关键。目前,临床上常用的递送载体分为两类:病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体因其较高的转染效率备受人们关注,但其制备过程复杂,可携带的外源基因有大小限制,且具有免疫原性,这些问题限制了病毒类载体的临床应用。大多数非病毒类载体在生理条件下带正电荷,如阳离子聚合物和阳离子脂质体等。它们通过电荷相互作用与带负电荷的核酸结合成稳定的复合物,通过内吞作用进入靶细胞。它们的制备过程相对简单,并且免疫原性低,但其导入外源基因的效率与病毒类载体相比,还有待提高。其中,多肽类载体作为非病毒类载体的一种,因生物相容性好、低免疫原性以及易于修饰等优点有潜力成为理想的基因递送载体。多肽类载体递送核酸进入细胞主要包括以下5个步骤:（1）载体与外源性核酸通过静电作用形成稳定的复合物;（2）复合物经过循环到达靶部位;（3）复合物被靶细胞摄取;（4）复合物从内涵体中逃逸并且释放出核酸分子;（5）外源性核酸在细胞内表达。针对上述过程可能出现的障碍,如细胞摄取、内涵体逃逸等,可采用功能片段合理组合的方式,得到一系列基于自组装的多肽载体,实现功能片段的协同作用进而突破递送障碍,最终实现核酸分子细胞内表达的目的。基于课题组前期研究基础,在肽载体序列中引入细胞透膜片段（R9或TAT）、内涵体逃逸片段（LLKK）3、疏水性基团硬脂酸可有利于增强载体与细胞膜磷脂双分子层的作用,进而提高内涵体逃逸能力。其中,C18-C（LLKK）3C-TAT在293T和NIH-3T3细胞中的转染效率和Lipo 2000相当。将赖氨酸（K）替换成组氨酸（H）后,得到的多肽载体C18-C（LLHH）3C-TAT的转染效率是Lipo 2000的3倍。这是因为引入组氨酸可通过“质子泵效应”进一步提高内涵体逃逸能力进而提高转染效率。为了进一步提高多肽载体的转染效率,本论文主要进行了以下两个方面的探究:1、基于staple策略提高多肽载体的α-螺旋度和稳定性,促进内涵体逃逸,提高载体的转染效率。采用staple策略对多肽载体进行修饰可以提高载体的α-螺旋含量、抗酶解能力以及内涵体逃逸能力,进而提高转染效率。本部分构建了基于staple策略的载体,并探究不同的修饰位点对载体构象及转染活性的影响。我们合成了PS-01～03三条钉合肽,以及未经过staple修饰的PS-04作为对照肽。实验结果显示,PS-01（Ac-CS5LHHS5LHHLLHHCGRKKRRQRRR）转染效率最佳,在N/P值为6时,其转染效率在293T细胞和NIH-3T3细胞上分别是阳性对照Lipo 2000的1.7和1.8倍。FACS和CLSM结果显示,staple策略可以有效提高细胞对复合物的摄取能力,且能实现EGFP基因在斑马鱼体内的转染。2、引入靶向片段,通过受体介导的内吞提高多肽载体的转染效率。基因递送过程中如果缺乏细胞靶向性,基因分子将难以到达靶部位发挥治疗效果,尤其是处于血脑屏障保护中的神经系统。神经系统疾病采用基因治疗难度较大的原因是:（1）神经细胞属于有丝分裂细胞,且分化成熟,因而本身难以转染;（2）神经细胞处于血脑屏障内,拥有天然的屏障。大多数神经细胞表面存在高表达的特异性受体,可通过配体与受体的相互作用,促进受体介导的胞吞,实现高效的基因转染。神经激肽1受体（NK1R）在多种神经肿瘤（如星形细胞瘤和胶质母细胞瘤）细胞中高表达,P物质（RPKPQQFFGLM）是NK1R的天然配体。本部分工作将P物质、连接臂PEG、疏水性基团硬脂酸、内涵体逃逸片段（LLHH）3以及阳离子透膜肽R9合理组合,构建了一系列多肽载体,P物质作为靶向片段可通过与NK1R特异性结合,促进细胞摄取提高载体的递送效率。实验结果显示,在高表达NK1R的U87和293T-NK1R细胞中,当N/P值为10时,P-02(RPKPQQFFGLM-PEG4-K(C18)-（LLHH）3-R9)的转染效率最好,分别是阳性对照Lipo 2000的6.1和5.7倍,而去掉靶向片段,转染效率与P-02相比,分别降低2和4倍。在体外血脑屏障模型中,P-02可以提高p GL3质粒透过血脑屏障能力。在斑马鱼模型中,P-02可实现EGFP基因在颅内表达。本论文的创新点:（1）基于staple策略提高肽载体的α-螺旋度和内涵体逃逸能力,从而提高多肽载体递送效率;（2）引入NK1R靶向片段,通过受体介导的内吞作用提高细胞摄取,进一步提高多肽载体对神经肿瘤细胞的转染效率。
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