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1995年科学家们发现了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白:TRAIL,它是肿瘤坏死因子超家族成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白。人类的TRAIL蛋白是由281aa组成的,由843bp个编码序列组成。其胞外区114~281aa为膜结合型TRAIL,能在体外诱导多种肿瘤细胞的凋亡。由于TRAIL具有广谱抗癌的功能,且其对与正常的组织和细胞几乎是无毒的,所以近年来它作为新型抗肿瘤药物在临床得到了广泛的应用。但是,对于某些种类的肿瘤细胞,TRAIL对它们诱导凋亡的作用并不明显。研究显示NF-κB的活性与TRAIL的作用密切相关左右,TRAIL可以激活NF-κB信号通路,而在NF-κB活性高的细胞系中,TRAIL的诱导凋亡效果明显下降。Par基因(prostate apop tosis response)是在1994年由Sells等人在鉴别筛选诱导凋亡的基因时,采用示差杂交法从凋亡的前列腺癌细胞中分离出的。par基因包括par-1、-2、-3、-4、-5,而其中par-4基因编码的Par-4蛋白与细胞凋亡的关系最为密切,在前列腺癌细胞凋亡时呈特异性双峰表达。Par-4基因位于人类染色体12q21上,其基因产物Par-4蛋白在细胞中广泛存在,在胞内胞外都具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,但不影响正常细胞的生长。因此Par-4就成为理想的抗肿瘤药物备选分子。Par-4蛋白的C端具有1个亮氨酸拉链结构域,其N端含有两个入核信号序列,分别为NLS1(20-25)和NLS2(137-153)。其中NLS2序列含有一个特殊的结构域SAC (the selective for apoptosis induction cancer cells),经过试验证实SAC即为Par-4诱导细胞凋亡的关键结构域,单独的SAC结构域即能产生诱导肿瘤细胞凋亡的作用。研究显示Par-4的凋亡作用主要是通过和分子伴侣GRP78结合,然后抑制NF-κB等通路来实现的。Par-4的这一特性正好弥补了TRAIL对某些NF-κB高活性的肿瘤细胞治疗效果不佳的缺陷。本研究中,我们尝试将SAC氨基酸片段与人TRAIL氨基酸片段以柔性氨基酸短臂,头尾相连融合成为一条多肽链SAC-TRAIL,即:SAC-(GGGGS)-TRAIL,以增强抗肿瘤的效果。我们通过PCR和限制性内切酶酶切、连接技术,获得编码蛋白SAC-TRAIL的基因序列,构建了含编码人SAC-TRAIL基因的重组质粒,在宿主菌E.coli BL21中得到了较高水平的表达,并用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对表达产物进行了初步纯化,获得了融合了麦芽糖结合蛋白标签的可溶性重组蛋白MBP-SAC-TRAIL。最后,对MBP-SAC-TRAIL的生物学活性进行初步研究。第一部分:SAC、SAC-TRAIL编码序列的构建和重组蛋白诱导表达与纯化以pBV220-TRAIL为模板设计一对引物,我们采用PCR技术扩增得到TRAIL。通过公司合成了SAC序列,将其中9个密码子更换为大肠杆菌偏爱型密码子,将此SAC序列作为模板设计引物,用PCR技术得到SAC序列。对SAC和TRAIL的PCR产物分别设计另两对引物进行PCR扩增使得两片段上附带一小段柔性氨基酸链接臂的编码序列,并且两片段首尾均带上了酶切位点;以pMAL-C2x为载体,利用酶切连接技术将酶切后的SAC、TRAIL、pMAL-C2三片段链接构建重组质粒。至此,获得重组蛋白SAC-TRAIL的基因编码序列。以E.coli BL21做为表达宿主菌,用测序正确的重组质粒pMAL-SAC-TRAIL进行转化,选取阳性克隆菌落用LB液体培养基培养,IPTG诱导表达重组蛋白MBP-SAC-TRAIL,并用MBP亲和层析柱纯化,经SDS-PAGE和免疫印迹验证,在预期分子量(约70KD)的位置可见明显蛋白条带。第二部分:SAC、SAC-TRAIL生物学活性研究用体外药物实验验证重组蛋白的诱导凋亡活性。体外培养肿瘤细胞(单细胞肺癌细胞H460),分为不给药的对照加MBP组、MBP-SAC-TRAIL组、MBP-TRAIL组,和加蛋白药物组进行对比,计算抑制率。之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡技术对正常细胞(人脐静脉内皮细胞HUVEC)和肿瘤细胞(单细胞肺癌细胞H460、胃癌细胞7901、胃癌细胞823、宫颈癌细胞HeLa),分为不给药的对照加MBP组、MBP-SAC-TRAIL组、MBP-TRAIL组,对5种细胞的凋亡情况进行检测和统计,从而评价重组蛋白的生物学活性。最后通过Western blot实验检测肿瘤细胞(单细胞肺癌细胞H460)的NF-κB信号通路激活情况,以验证融合蛋白的双功能。实验结果:编码SAC-TRAIL的基因序列获得成功地构建并克隆,重组蛋白在原核表达系统中高效表达,大部分融合蛋白在细胞破碎后的上清中以水溶形式存在,其表达量为15.9%,并能被MBP亲和层析柱分离纯化,纯化后蛋白纯度达到89.6%。体外细胞实验证明,MBP-SAC-TRAIL具有很强的抗肿瘤活性。在50μM的浓度下,作用12个小时后4种肿瘤细胞均发生不同程度的凋亡,与MBP-TRAIL给药组的差异有统计学意义。其中H460细胞凋亡率最为明显,达到了17.4%,而相同浓度的MBP-TRAIL加药组凋亡率仅有6.1%。以上实验结果表明MBP-SAC-TRAIL融合蛋白诱导凋亡的生物学活性明显高于MBP-TRAIL,这预示着该蛋白在肿瘤临床治疗上具有良好的应用前景。