猪肠道冠状病毒病主要病原是猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪重组肠道冠状病毒(Se CoV)以及新近报道的猪肠道阿尔法冠状病毒(PEACoV)。这些病原感染导致猪不同程度的肠道问题,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前,世界范围内猪肠道冠状病毒病呈现出新发和再发特点。传统意义上,TGEV和猪A群轮状病毒(RV)可引起不同日龄仔猪发生腹泻。但自2010年底以来,免疫猪群中出现了变异PEDV导致包含中国和美国在内的全球主要养猪国家发生PED,造成严重经济损失。本文围绕猪流行性腹泻病毒的感染和分子特征及下一代测序技术在新病原挖掘方面的应用进行了如下研究:1.我国PED流行情况及PEDV的分子特征2010年底以来,以免疫猪群发病、传播速度快、季节性不明显、发病率和死亡率高为临床特征的腹泻病在我国主要养猪区蔓延。为了研究我国三种常见病原的感染特点,本研究使用三重RT-PCR方法(PEDV、TGEV和Po RV)检测了我国2012年至2015年的采集的2643份临床样品。结果表明,这一期间PEDV、TGEV和Po RV的检出率分别是61.1%(1615/2643)、0.6%(12/2076)和5.2%(95/1828)。在此基础上,为了增加对中美两国新型PEDV毒株基因特征的了解,本文测定了不同PEDV毒株的全S基因和全基因组序列,并进行了比对分析,阐明了新毒株与传统疫苗毒株之间的基因差异。为了进一步研究我国不同PEDV毒株的多样性,本研究对其中的91份典型样品的S1(1-1323bp)以及其中的46个样品的ORF3基因进行了测序,结果显示变异PEDV毒株基因型在我国占主导地位。发现了区分不同PEDV毒株的分子标记,为建立鉴别诊断方法奠定基础。同时与国内同期报道的314个PEDV毒株基因序列进行比较分析,旨在揭示我国猪流行性腹泻的病原学特点。2.美国PED流行情况及PEDV的分子特征通过分析了UMVDL提供的2016年12月-2017年5月来源于美国24个州的13,269份样品的三重(PEDV、PDCoV和TGEV)定量RT-PCR的检测数据。检测结果表明PEDV、PDCoV和TGEV的检出率分别是5.8%(763/13,269)、1.0%(137/13,269)和低于0.01%(2/13,269),结果表明,PEDV是最常见的猪腹泻性病原。序列测定发现,在美国流行的PEDV毒株主要分为新发的强毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株。为了给临床检测提供快速简便方法,依据这两种PEDV S基因序列差异,设计引物,通过条件优化,建立了具有良好特异性和敏感性的二重RT-PCR鉴别诊断方法。应用该方法检测287份PEDV阳性样品,结果表明强毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株单独感染的比率分别为80.8%(232/287)和14.6%(42/287),这两种毒株的混合感染率是1.0%(3/287)。结果表明该方法与之前报道的定量RT-PCR方法的的符合率为:INDELs PEDV毒株91.3%(42/46)、强毒力PEDV毒株96.6%(229/237)和INDELs PEDV毒株和毒力PEDV毒株75%(3/4)。统计学分析表明两种检测方法差异不显著。3.新型PEDV毒株分离鉴定和传代致弱研究从临床上发生典型腹泻猪场(该猪场存在严重的腹泻问题,一周龄仔株的死亡率可以高达80%)的仔猪病料中,分离到一株具有代表性的新型PEDV毒株,S基因和全基因组测序,与PEDV流行毒株的同源性较高,确定是变异毒株,命名为PEDV YN1株。为了解新型PEDV毒株的特点以及为减毒疫苗研制奠定基础。将YN1株在Vero细胞上连续传代200代次,采集不同代次病毒进行全基因组测序,明确了不同代次病毒的基因变化特点,分析基因变化与细胞适应性、毒力之间的关系。通过比较新型PEDV毒株YN1与其不同代次衍生毒株的全基因组序列发现,伴随着传代过程,PEDV全基因组序列变化加剧,NSP2、NSP4-7、NSP10、NSP12和NSP13和新型PEDV毒株的细胞适应性没有直接的关系。不同PEDV毒株的毒力减弱的分子特点是ORF1a/b和S蛋白存在9-26aa的改变,S蛋白存在1-3个aa的缺失,ORF3的提前终止和8aa的改变,E、M和N蛋白存在1-3aa的改变。一些核苷酸水平的同义突变,可能也会对新型PEDV毒株的减毒有关。S蛋白144aa位点的1aa的缺失是新型PEDV毒株减弱的标志。结合动物感染试验结果,表明ORF3基因的提前终止对PEDV毒株的细胞适应性比对其减毒性更为重要。将传代致弱的PEDV YN144株接种仔猪,没有观察到腹泻症状,表明YN144为减毒毒株。有限的临床试验证明,该毒株对仔猪和妊娠母猪安全,并能刺激母猪在乳汁中产生针对PEDV的Ig A,具有作为口服疫苗的潜力,为后续的新型PEDV毒株弱毒疫苗的研究奠定基础。4.下一代测序技术在新病原挖掘方面的应用本研究通过下一代测序方法(NGS)在美国发现了新型TGEV毒株。对明尼苏达大学兽医诊断实验室(UMVDL)提供采集自美国41个州的2008年1月至2016年11月份的29,397个临床病料的TGEV定量检测数据进行了分析,研究了这期间美国TGE的流行情况,结果表明TGE在美国呈现周期性的发生,在寒冷的季节多发。2013年之后TGEV在美国的检出小于0.4%。其次通过从头测序组装和比对,我们获得了18株美国TGEV的全基因组序列及一株美国PRCV毒株的全基因组序列,这18株TGEV毒株中,有16株拥有独特的8个基因缺失位点以及199个氨基酸序列的改变。遗传进化树分析表明,这16个毒株形成了新的进化分支。这种新型TGEV毒株在美国占主导地位,但其临床意义还需要进一步研究。对新近发现和鉴定的PRCV的全基因组序列分析发现,该毒株和美国TGEV毒株之间存在重组现象。综上所述,通过对中美猪肠道冠状病毒病的流行情况调查发现,其首要病原是PEDV。对中美PEDV毒株的的分子特征和分子流行病学的研究阐释了中美PED复杂的感染情况。对我国变异PEDV毒株分离和传代致弱的研究揭示了我国变异PEDV毒株的生物学特征并为后续弱毒苗的研制奠定基础。通过研究NGS在新病原挖掘方面的应用,可以帮助我们更好的应对新发和再发兽医临床疾病(比如新发的新型PED)。