几丁质酶在工业、农业、医药及生物防治等方面具有重要的作用和应用价值。重要的生防细菌苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）也能产生几丁质酶。由于几丁质酶不但可以抑制真菌生长，还有明显的杀虫增效作用，不少国内外学者对Bt几丁质酶的应用及其编码基因进行了广泛研究。然而Bt几丁质酶的表达方式至今尚无定论，几丁质酶基因（chi）表达调节机理的研究几乎为零。本研究旨在确定Bt几丁质酶表达方式的基础上，研究该基因的遗传调控元件，从而为揭示几丁质酶基因表达调节机理提供理论依据。为了能够对Bt几丁质酶的表达方式有系统、全面的了解，采用DNS法检测了77株Bt菌在有或无诱导物培养基中的几丁质酶活力，发现不同Bt菌株之间酶活力差异非常大。无几丁质诱导下，全部实验菌株都能或多或少产生几丁质酶，保持一定量的基础表达；添加诱导物之后，41%的菌株酶活力几乎没有变化，56%菌株有一定提高。在酶活力提高的菌株中，诱导效率存在很大差异，绝大部分菌株诱导效果不是很显著。在此研究基础上，考查了葡萄糖对酶活力的影响，以及葡萄糖抑制与几丁质诱导之间的关系。经统计分析发现，葡萄糖能够抑制几丁质的诱导作用，但是不能完全抑制Bt菌株几丁质酶的基础表达，Bt菌株并不完全遵循诱导型对葡萄糖敏感、组成型抗葡萄糖的规律。证明苏云金芽胞杆菌在几丁质酶诱导表达的调节方式上具有复杂的多态性。在所检测的菌株中，发现75号菌株（Bt75）几丁质酶诱导表达最为明显，诱导效率达9.7倍，选取这株菌用于研究几丁质酶基因的表达调节。为研究Bt几丁质酶基因表达调节的分子基础，需要构建一个研究启动子功能的载体工具。通过检测证明，Bt75菌株中无明显内源性的β-半乳糖苷酶活性，因此选择了嗜热脂肪地芽胞杆菌β-半乳糖苷酶基因bgaB作为报告基因，在穿梭载体pHT315的基础上构建芽胞杆菌启动子探测型载体。当把无启动子且经过修饰的bgaB基因连入pHT315构建成pHT-bgaB后，发现转化子表现出了明显的β-半乳糖苷酶活力，证明pHT315载体中存在未知的启动子而造成bgaB基因的表达。为了终止这一潜在启动子引起的转录通读，在bgaB基因上游又插入了大肠杆菌转录终止子rrnBT1T2序列，最终成功获得目的质粒pCB。含有质粒pCB的大肠杆菌和Bt75中都检测不出任何β-半乳糖苷酶活性。将Bt75菌株chiA、chiB基因调控区域连入载体pCB，获得的重组质粒电转化入原始菌株Bt75，得到的转化子中chiA、chiB基因启动子的诱导表达特性与原始菌株中几丁质酶的诱导合成特性一致。证明利用自行构建的启动子探测型载体pCB，完全可以开展本研究计划的后续所有工作。通过对chiA调控序列的一系列缺失突变对酶活力影响的分析，发现调控序列从5′端缺失到-116bp处或从3′端缺失到-42bp处时启动子仍然保持明显的活性，更多缺失却导致启动子活性丧失，且只含-116至-42bp的片段照常启动基因的表达，证实chiA结构基因ATG上游-116至-42bp位点之间长75bp的序列是chiA基因的核心启动子，-116bp处的所有上游序列和-21bp处的全部下游序列对于chiA基因的表达和调控是非必须的，实验结果与软件预测的启动子不吻合。研究发现和证实在核心启动子下游、-20bp处上游附近存在一个应答几丁质诱导的负调控位点，缺失或破坏这个位点导致chiA启动子由诱导型表达转变为组成型表达。另外，通过5′RACE技术，证实在chiA基因核心启动子内，结构基因ATG上游-46bp处的“A”碱基是chiA基因的转录起始位点，由此确定chiA基因启动子的-35区和-10区分别为“TTACAA”和“TATCAT”。通过对chiB调控序列的一系列缺失突变对酶活力影响的分析，结果显示调控序列从5′端缺失至-324bp处和从3′缺失至-41bp处时对启动子的活性和诱导表达特性没有任何影响。证明这些序列对于chiB基因的表达是非必须的。从5′端缺失至-232bp处或从3′端缺失至-121bp处时启动子活性降低，但仍然保持明显的活性，在此基础上继续缺失导致启动子活性完全丧失。而只含-232至-121bp的片段仍然保持一定的启动子活性。由此证实chiB结构基因ATG上游-232至-121bp位点之间的序列为基因的核心启动子，与chiA不同，其上游及下游序列对启动子的活性具有一定影响。同时证实chiB基因转录起始位点为结构基因ATG上游-132bp处的“C”碱基，chiB基因启动子的-35区和-10区序列分别为“TTTACA”和“TACGAT”。缺失分析还证明在chiB核心启动子下游、-97bp处上游附近存在一个应答几丁质诱导的负调控位点（dre），该位点是一段长16bp位于-112至-97bp之间具有部分反向重复特征的保守序列，缺失或部分缺失这个位点，导致原本是诱导型表达的chiB启动子转变为组成型表达。通过对dre位点中7个碱基进行定点置换后对酶表达方式影响的研究，所获得的20个突变中有14种突变导致chiB启动子由诱导型表达转变为组成型表达。证实dre位点参与了chiB基因诱导表达的调节，其中一些碱基对于dre位点行使功能起着至关重要的作用。Northern杂交分析也证实，dre位点中关键碱基置换后，明显提高chiB基因转录的mRNA量。这些结果证明dre位点在转录水平上调控chiB基因的表达。通过体外凝胶电泳迁移率变动分析也证实，Bt细胞中存在一种蛋白，在无诱导物的情况下能够结合包括chiB基因dre位点在内的调控区域，有诱导物存在时则脱离chiB调控区域。上述有关chiA、chiB基因表达调节关键遗传元件的研究结果，为最终提出Bt几丁质酶表达调控模型及机制提供了研究基础。此外，为了了解Bt几丁质酶基因表达的时间段，利用报告基因对chiA、chiB基因启动子在菌体不同培养时间段的活性进行了测定。结果显示在菌体的生长初期两个基因的启动子都没有任何活性，直至菌体生长到对数生长后期时才开始启动基因表达，此后，酶的合成量稳步上升，在稳定期时达到最大，稳定期后期之后，基因的表达量基本不再增加。发现几丁单糖（GlcNAc）不是Bt75菌株几丁质酶基因的有效诱导物。