论文部分内容阅读
油菜属于十字花科芸薹属，是世界四大油料作物(大豆、油菜、花生、向日葵)之一，也是重要的经济作物。甘蓝型油菜因其高产和强抗病性而具有重要的生产价值，在世界范围内被广泛种植。生育期作为作物生长发育特性的综合标志，是油菜重要的农艺性状。选育生育期适当的油菜早熟品种，使油菜生长后期避开高温高湿天气是我国油菜育种的主要目标之一。
为了探索甘蓝型油菜生育期及相关性状的遗传基础和分子标记辅助选育油菜早熟新品种中的应用，本研究利用重组自交系(RIL)群体进行连锁分析，并利用自然群体进行关联分析来鉴定油菜生育期及相关性状(初花期、终花期、花期长度和成熟期)QTL。此外，从RIL群体筛选出早、晚花极端材料进行转录组测序，结合定位数据，鉴定生育期相关性状候选基因。同时，以甘蓝型油菜中双11(ZS11)为材料，利用基因表达谱数据和荧光定量PCR技术，分析BnamiR156及BnaSPL3在不同组织中的表达模式，最终筛选出关键成员。通过构建超量表达载体和表达抑制载体，并在拟南芥中异源表达，分析它们在甘蓝型油菜开花诱导过程中的功能，为分子设计育种提供理论依据。主要得出以下研究结果：
1.生育期及相关性状的QTL定位
对以GH06为母本，P174为父本构建的包含172个株系的重组自交系群体生育期性状进行连续两年(2017年、2018年)表型统计，结合实验室前期构建的高密度SNP遗传连锁图谱，利用WinQTLCart2.5软件复合区间法检测到控制甘蓝型5个生育期相关性状的显著QTL83个，其中15个QTL至少与两个生育期性状相关。其中，2018年检测到的位于A01染色体上的初花期q18DIF.A01-2与终花期q18DFF.A01，成熟期q18MT.A01-1置信区间相互重叠，且具有最高的加性效应，贡献率分别为14.99%，15.92%和18.30%。因此推测q18DIF.A01-2是生育期主效QTL。基于油菜基因组注释和检测到的QTL置信区间所在的物理位置，共鉴定出73个拟南芥开花同源基因。
2.生育期及相关性状的关联分析
选取来自世界各地的588份油菜种质资源，在连续3年生育期相关性状表型鉴定的基础上(2017年、2018年和2019年)，为了最大限度减少环境变异的影响，我们计算出5个生育期性状各品系的最佳线性无偏预测(BLUP)值。对5个生长期性状分别选择最优MLM模型，利用覆盖全基因组的385691个SNP标记对3年表型数据和其对应BLUP值进行关联分析。我们主要关注至少在两种环境以上稳定检测到的SNPs，共鉴定出146个与5个生育期性状显著相关的SNP位点，构成了19个长度不一的单倍型块。与前人关于生育期相关性状定位结果比较，共有28个SNP位点位于或接近之前鉴定到的QTL置信区间内。以单倍型块所在区间或显著SNPs上下游各300kb为置信区间，共鉴定出101个与拟南芥开花基因同源的候选基因。此外，有5个SNP被检测到同时与2个及以上的生育期性状显著相关。
3.早、晚花材料转录组分析
从RIL群体中选择了早花材料(18Z134)和晚花材料(18Z88)，分别对营养生长期和生殖生长期的叶片取材，构建了4个cDNA文库，并利用RNA-Seq技术进行测序。对早、晚花材料不同发育时期共有的DEGs进行GO注释富集分析，显著富集的GOterm包括对寒冷的响应、花器官脱落负调控、胞内生长素运输和长日照开花等。KEGG富集分析结果表明，昼夜节律-植物和植物激素信号转导显著富集，可能参与植物营养生长向生殖生长的过渡和开花过程。对同一时期不同材料的DEG分别进行GO和KEGG富集分析，结果说明参与红光、远红光响应和昼夜节律的基因表达不同可能是导致开花差异的主要原因。基于BLASTP分析，共检测到125个参与开花诱导的DEGs，分别参与五大开花途径，包括昼夜节律/光周期、春化、赤霉素信号和年龄途径等，还有一些基因编码开花整合基因或花分生组织特征基因，这些DEGs在甘蓝型油菜中形成了复杂的开花调控网络。
4.生育期及相关性状候选基因的筛选
将转录组鉴定到的DEGs与关联分析、连锁分析鉴定到的显著QTLs进行整合，共有12个DEGs被进一步确定为生育期相关性状的候选基因。进一步分析了12个候选基因在588份栽培油菜中的序列变异，在7个候选基因中发现了SNP多态性位点，并组成了不同的单倍型。其中单倍型BnaSOC1.A05-Haplb、BnaTOC1.C09-Haplc和BnaLNK2.C06-Hapla表现出更有利的早熟性状，可用于下一步的生育期分子标记辅助育种。
5.甘蓝型油菜miR156靶基因的识别和鉴定
根据拟南芥SPL3氨基酸序列，利用BLASTP在甘蓝型油菜中筛选到5个SPL3同源基因，通过Pfam和SMART分析证实了5个SPL3基因均具有完整SBP结构域。利用TAPIR和psRNATarget预测到5个BnaSPL3均为甘蓝型油菜miR156的潜在靶基因，并在5个基因的3’-UTR区均含有miR156/157互补序列。
6.甘蓝型油菜miR156及SPL3的表达模式分析
根据本课题组前期ZS11不同组织部位转录组测序结果，5个BnaSPL3成员主要在雌蕊中特异性表达。荧光定量PCR结果表明：BnaSPL3.Cnng在花瓣和雌蕊中表达量较高，BnaSPL3.C04在根、花、蕾和雌蕊中表达量较高，BnaSPL3.A05在花蕾和雌蕊中表达量较高；而成熟的BnamiR156b主要在茎和萼片中表达，在花蕾和雌蕊中表达量较低。BnaSPL3.C04的表达模式与miR156b的表达模式相反，推测其可能受到BnamiR156b的负调控。所以我们把BnaSPL3.C04作为下一步功能验证的候选基因。
7.甘蓝型油菜miR156及SPL3.C04在开花诱导中的功能研究
本研究克隆了甘蓝型油菜miR156b和miR156g前体基因片段，并分别构建超量表达载体；同时克隆了拟南芥IPS1，以此为骨架构建了抑制miR156表达的mimicry156载体。将超量表达和抑制表达载体分别转化拟南芥，经PPT(草甘膦)筛选和PCR检测获得纯合的T3代转基因植株。通过对转基因株系进行观察统计，发现过表达miR156b和miR156g转基因拟南芥与野生型对照相比，均表现出莲座叶数目增多、晚花、营养阶段向生殖阶段转变推迟等特点；MIM156转基因拟南芥与野生型对照相比，表现为早花，莲座叶片数减少，时期转变提前。除了对开花的影响外，miR156还能调控植株形态，miR156过表达植株与对照相比表现出株高降低，分枝增多等特点。
同时构建了pEarlyGate101-BnaSPL3.C04过量表达载体，并通过花序浸染法将其导入拟南芥，经PPT筛选和PCR检测获得纯合的T3代转基因植株。转基因株系与野生对照相比，开花时间提前，株高增加。综合以上结果表明miR156及SPL3.C04是甘蓝型油菜开花以及生长发育的重要调控因子。
8.BnaSPL3.C04参与甘蓝型油菜开花途径研究
对野生型WT和转基因拟南芥(35S::MIM156，35S::miR156b和35S::SPL3.C04)进行转录组分析，KEGG富集分析显示差异基因主要在植物激素信号传导和昼夜节律等通路显著富集。结合qRT-PCR分析结果进一步表明BnaSPL3.CO4通过开花整合基因SOC1、FUL等整合多个开花信号途径包括年龄途径、光周期途径和GA途径来诱导拟南芥时相转变和早期开花。
为了探索甘蓝型油菜生育期及相关性状的遗传基础和分子标记辅助选育油菜早熟新品种中的应用，本研究利用重组自交系(RIL)群体进行连锁分析，并利用自然群体进行关联分析来鉴定油菜生育期及相关性状(初花期、终花期、花期长度和成熟期)QTL。此外，从RIL群体筛选出早、晚花极端材料进行转录组测序，结合定位数据，鉴定生育期相关性状候选基因。同时，以甘蓝型油菜中双11(ZS11)为材料，利用基因表达谱数据和荧光定量PCR技术，分析BnamiR156及BnaSPL3在不同组织中的表达模式，最终筛选出关键成员。通过构建超量表达载体和表达抑制载体，并在拟南芥中异源表达，分析它们在甘蓝型油菜开花诱导过程中的功能，为分子设计育种提供理论依据。主要得出以下研究结果：
1.生育期及相关性状的QTL定位
对以GH06为母本，P174为父本构建的包含172个株系的重组自交系群体生育期性状进行连续两年(2017年、2018年)表型统计，结合实验室前期构建的高密度SNP遗传连锁图谱，利用WinQTLCart2.5软件复合区间法检测到控制甘蓝型5个生育期相关性状的显著QTL83个，其中15个QTL至少与两个生育期性状相关。其中，2018年检测到的位于A01染色体上的初花期q18DIF.A01-2与终花期q18DFF.A01，成熟期q18MT.A01-1置信区间相互重叠，且具有最高的加性效应，贡献率分别为14.99%，15.92%和18.30%。因此推测q18DIF.A01-2是生育期主效QTL。基于油菜基因组注释和检测到的QTL置信区间所在的物理位置，共鉴定出73个拟南芥开花同源基因。
2.生育期及相关性状的关联分析
选取来自世界各地的588份油菜种质资源，在连续3年生育期相关性状表型鉴定的基础上(2017年、2018年和2019年)，为了最大限度减少环境变异的影响，我们计算出5个生育期性状各品系的最佳线性无偏预测(BLUP)值。对5个生长期性状分别选择最优MLM模型，利用覆盖全基因组的385691个SNP标记对3年表型数据和其对应BLUP值进行关联分析。我们主要关注至少在两种环境以上稳定检测到的SNPs，共鉴定出146个与5个生育期性状显著相关的SNP位点，构成了19个长度不一的单倍型块。与前人关于生育期相关性状定位结果比较，共有28个SNP位点位于或接近之前鉴定到的QTL置信区间内。以单倍型块所在区间或显著SNPs上下游各300kb为置信区间，共鉴定出101个与拟南芥开花基因同源的候选基因。此外，有5个SNP被检测到同时与2个及以上的生育期性状显著相关。
3.早、晚花材料转录组分析
从RIL群体中选择了早花材料(18Z134)和晚花材料(18Z88)，分别对营养生长期和生殖生长期的叶片取材，构建了4个cDNA文库，并利用RNA-Seq技术进行测序。对早、晚花材料不同发育时期共有的DEGs进行GO注释富集分析，显著富集的GOterm包括对寒冷的响应、花器官脱落负调控、胞内生长素运输和长日照开花等。KEGG富集分析结果表明，昼夜节律-植物和植物激素信号转导显著富集，可能参与植物营养生长向生殖生长的过渡和开花过程。对同一时期不同材料的DEG分别进行GO和KEGG富集分析，结果说明参与红光、远红光响应和昼夜节律的基因表达不同可能是导致开花差异的主要原因。基于BLASTP分析，共检测到125个参与开花诱导的DEGs，分别参与五大开花途径，包括昼夜节律/光周期、春化、赤霉素信号和年龄途径等，还有一些基因编码开花整合基因或花分生组织特征基因，这些DEGs在甘蓝型油菜中形成了复杂的开花调控网络。
4.生育期及相关性状候选基因的筛选
将转录组鉴定到的DEGs与关联分析、连锁分析鉴定到的显著QTLs进行整合，共有12个DEGs被进一步确定为生育期相关性状的候选基因。进一步分析了12个候选基因在588份栽培油菜中的序列变异，在7个候选基因中发现了SNP多态性位点，并组成了不同的单倍型。其中单倍型BnaSOC1.A05-Haplb、BnaTOC1.C09-Haplc和BnaLNK2.C06-Hapla表现出更有利的早熟性状，可用于下一步的生育期分子标记辅助育种。
5.甘蓝型油菜miR156靶基因的识别和鉴定
根据拟南芥SPL3氨基酸序列，利用BLASTP在甘蓝型油菜中筛选到5个SPL3同源基因，通过Pfam和SMART分析证实了5个SPL3基因均具有完整SBP结构域。利用TAPIR和psRNATarget预测到5个BnaSPL3均为甘蓝型油菜miR156的潜在靶基因，并在5个基因的3’-UTR区均含有miR156/157互补序列。
6.甘蓝型油菜miR156及SPL3的表达模式分析
根据本课题组前期ZS11不同组织部位转录组测序结果，5个BnaSPL3成员主要在雌蕊中特异性表达。荧光定量PCR结果表明：BnaSPL3.Cnng在花瓣和雌蕊中表达量较高，BnaSPL3.C04在根、花、蕾和雌蕊中表达量较高，BnaSPL3.A05在花蕾和雌蕊中表达量较高；而成熟的BnamiR156b主要在茎和萼片中表达，在花蕾和雌蕊中表达量较低。BnaSPL3.C04的表达模式与miR156b的表达模式相反，推测其可能受到BnamiR156b的负调控。所以我们把BnaSPL3.C04作为下一步功能验证的候选基因。
7.甘蓝型油菜miR156及SPL3.C04在开花诱导中的功能研究
本研究克隆了甘蓝型油菜miR156b和miR156g前体基因片段，并分别构建超量表达载体；同时克隆了拟南芥IPS1，以此为骨架构建了抑制miR156表达的mimicry156载体。将超量表达和抑制表达载体分别转化拟南芥，经PPT(草甘膦)筛选和PCR检测获得纯合的T3代转基因植株。通过对转基因株系进行观察统计，发现过表达miR156b和miR156g转基因拟南芥与野生型对照相比，均表现出莲座叶数目增多、晚花、营养阶段向生殖阶段转变推迟等特点；MIM156转基因拟南芥与野生型对照相比，表现为早花，莲座叶片数减少，时期转变提前。除了对开花的影响外，miR156还能调控植株形态，miR156过表达植株与对照相比表现出株高降低，分枝增多等特点。
同时构建了pEarlyGate101-BnaSPL3.C04过量表达载体，并通过花序浸染法将其导入拟南芥，经PPT筛选和PCR检测获得纯合的T3代转基因植株。转基因株系与野生对照相比，开花时间提前，株高增加。综合以上结果表明miR156及SPL3.C04是甘蓝型油菜开花以及生长发育的重要调控因子。
8.BnaSPL3.C04参与甘蓝型油菜开花途径研究
对野生型WT和转基因拟南芥(35S::MIM156，35S::miR156b和35S::SPL3.C04)进行转录组分析，KEGG富集分析显示差异基因主要在植物激素信号传导和昼夜节律等通路显著富集。结合qRT-PCR分析结果进一步表明BnaSPL3.CO4通过开花整合基因SOC1、FUL等整合多个开花信号途径包括年龄途径、光周期途径和GA途径来诱导拟南芥时相转变和早期开花。