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本研究以甘薯品种徐薯18的胚性悬浮细胞团为受体材料,对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化体系进行了优化。同时利刚农杆菌介导法将bar基因导入品种栗子香和徐薯18中,获得了对除草剂具有高度抗性的转基因植株;并且用bar基因作为筛选标记基因,将SOS基因导入栗子香和徐薯18中。主要结果如下:
1.将质粒pBI121的gusA基因的酶切片段插入质粒pCAMBIA3300的多克隆位点,构建新的双元载体pCAMBIA3300/GUS,并将其导入农杆菌菌株EHA105中。以徐薯18的胚性悬浮细胞为材料,对转化体系进行了优化。利用GUS瞬时表达比较了甘露醇预处理及不同共培养方式对转化效果的影响,结果表明,在共培养培养基中添加30mg/L,乙酰丁香酮时,非甘露醇预处理、液体静置共培养的胚性细胞团的Gus瞬时表达率最高,液体静置共培养适宜的共培养时间为2 d。
2.对栗子香和徐薯18胚性细胞团对PPT的敏感性进行了分析,结果表明选择培养基中适宜的PPT浓度分别为0.5 mg/L和0.3m/L。用根癌农杆菌菌株EHA105,分别转化870个栗子香的胚性细胞团和480个徐薯18的胚性细胞团,通过选择培养,分别获得了165个和81个PPT抗性愈伤组织。其中的139个和62个抗性愈伤组织通过体细胞胚胎发生途径,分别再生出1431株和276株拟转基因植株。GUS检测以及PCR、Southern blot和Northern blot分析表明,外源基因已经整合到甘薯品种的基因组中;栗子香再生植株中转基因植株占拟转基因植株的86%,徐薯18的再生植株中75%为转基因植株。除草剂喷洒实验表明,转基因植株对正常大田剂量甚至更高剂量的除草剂表现出很强的抗性,说明bar基因在转基因植株中得到了有效的表达。未发现转基因植株在形态学上的变异。将抗除草剂的bar基因导入到甘薯品种中,不仅可以获得抗除草剂的转基因甘薯,而且bar基因也可作为一种选择标记基因,为用基因工程改良甘薯提供一种有效手段。
3.以bar基因为选择标记基因,用携带双元载体pCAMBIA3301(含有bat基因和SOS1、SOS2、SOS3基因)的农杆菌菌株EHA105分别转化栗子香的101个胚性细胞团和徐薯18的239个胚性细胞团,选择培养8周后,分别获得15个和31个PPT抗性愈伤组织。其中的10个和28个愈伤组织再生得到了拟转基因再生植株,并对其进行了PCR分析。