细胞分裂素(Cytokinin,CK)是一种重要的嘌呤类的植物激素,参与植物生长发育的许多方面,包括解除顶端优势、促进茎的伸长、抑制根的伸长、延缓叶片衰老和叶绿素降解、刺激叶片扩大以及响应生物与非生物胁迫等。细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(Cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKX;EC.1.599.12),是一种能不可逆地把CK降解为腺嘌呤/腺苷的黄素酶,对于维持植物体内CK的平衡至关重要。过表达CKX的植物显示出对干旱以及高盐的耐受性。另外,抑制CKX表达可引起植物花序分生组织中CK的积累,从而导致更高的种子产量。桑树是一种多年生生态经济型林木,具有分布广泛、环境适应能力强的特点。桑椹被称为“第三代水果”,富含有花青素、生物碱、多酚等次生活性物质,酸甜可口,是深受人们喜爱的一种水果。但桑树的抗逆性、富含次生代谢物质以及不同品种间聚合果性状差异等分子机理仍不是很清楚。CKX是水稻、小麦、烟草和拟南芥等植物中调节作物产量和抗性的一个重要的目标基因,而桑树中CKX基因的生物学功能仍是未知的。因此,我们克隆和鉴定了桑树的CKX基因,通过分析它们在花器官、逆境胁迫以及桑树各组织中的表达模式,以期阐明桑树CKX基因的功能,为调节桑椹产量、增强桑树逆境胁迫能力奠定基础,也对补充和完善CKX基因在木本植物中的功能具有重要的意义。本研究中我们首先采用生物信息学方法,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库中鉴定到6个CKX基因,命名为MnCKX1~MnCKX6并分析了它们的序列特征。随后,利用实时定量PCR(qRT-PCR)分析MnCKX的时空表达。为研究MnCKX的功能,我们获得了MnCKX过表达的转基因烟草植株。得到了如下研究结果:1、MnCKX基因的鉴定、克隆、生物信息学分析以及它们的时空表达模式MnCKX1-6含有3到5个数量不等的内含子和典型的细胞分裂素氧化酶/脱氢酶的结构域,FAD binding以及cytokinin-bind结构域。根据川桑基因组分析结果,MnCKX5和MnCKX6以串联重复对存在。SignalP在线预测信号肽发现MnCKX1,mnckx5以及mnckx6含有信号肽,推断它们可能是一类分泌蛋白。netglycate在线预测糖基化位点发现mnckx之间赖氨酸糖基化位点数目差异较大,最少的mnckx3是8个,最多的mnckx2有17个之多。依据拟南芥与川桑ckx的蛋白序列,我们构建了系统进化树,并且发现mnckx5,mnckx6与atckx3聚为一支,暗示它们可能行使相类似的生物学功能。plantcare在线预测mnckx基因上游启动子1.5kb区域的转录调控位点,发现mnckx基因有多类顺式作用元件,包括非生物胁迫以及生物胁迫的转录位点,这暗示mnckx基因可能响应非生物胁迫与生物胁迫的应答。我们检测了川桑的雄花、雌花、根、叶、皮和茎中mnckx基因的表达。qrt-pcr结果显示mnckx1和mnckx6分别在根和茎中的表达量最高,川桑雌花中mnckx4的表达量最高。与其他mnckx比较,mnckx2和mnckx3在川桑的6个组织中都显示出最低的表达水平。转录组数据结果暗示mnckx2可能是一个雄花特异性基因。为了验证这个假设,我们检测了不同白桑品种的花中mnckx2表达水平。结果表明,mnckx2在白桑的雄花中表达量最高,因此猜测它有可能是一个雄花特异性基因。进一步检测了6-ba对桑树mnckx基因表达的影响发现,在6-ba持续刺激下的川桑苗中mnckx5表达量最高,mnckx1和mnckx2的表达较低。同时为了检测短期6-ba刺激对mnckx基因表达的影响,我们对川桑苗分别进行12h和36h的6-ba刺激处理。我们发现mnckx1,mnckx2,mnckx3和mnckx4在12h有轻微的上调表达,然后在36h下降。而mnckx5和mnckx6的表达则在36h内持续的积累,其中mnckx6的表达甚至是对照的50倍之多。为了检测mnckx基因是否参与桑树花器官的发育,我们选取桑果中小果数最少的垂桑和最多的长果桑来检测mnckx基因的表达。结果显示,在这两种小果数量不同的桑树品种中表达量差异最大的是基因是mnckx3和mnckx4,且mnckx3和mnckx4在垂桑中的表达水平比在长果桑中的表达水平要高。这表明mnckx3和mncx4可能参与桑树花器官的发育。2、mnckx基因在非生物胁迫下的表达模式分析了3个候选基因mnpod、mnrd22以及mncat1在干旱和高盐中的表达模式。mnpod在干旱和高盐胁迫下表达量急剧改变,表明mnpod是川桑非生物胁迫下的一个较为理想的标记基因。在此基础上,我们检测了干旱以及高盐胁迫下mnckx基因的表达特征。qrt-pcr结果显示,mnckx1和mnckx6在两种胁迫下持续的表达上调,其他mnckx基因的表达保持不变或有轻微的改变。3、MnCKX1及MnCKX6在转基因烟草中的功能验证因MnCKX1和MnCKX6在根、茎以及胁迫下表达量最高,我们构建了含有MnCKX1和MnCKX6的两个超量表达载体,并通过叶盘转化法转化到烟草中研究它们在烟草中的功能。GUS组织化学染色结果表明,不同的转基因烟草植株叶片的染色不同。基因组PCR及qRT-PCR结果都表明我们获得了转基因烟草阳性植株。转基因烟草植株显示出了地上部分生长矮小的性状。这表明MnCKX1和MnCKX6在转基因烟草中的过量表达可能降低了转基因烟草体内CK的含量,进而影响了转基因烟草植株地上部分与地下部分的正常发育,出现了典型的CK缺失症状。叶圆片实验表明转基因烟草植株CKX1-1叶绿素含量比野生型的高,与MnCKX1在该转基因植株中的高表达水平一致。MnCKX6在转基因植株CKX6-3中表达量高,但是叶绿素含量与野生型相比没有达到显著水平,可能是因为MnCKX6编码的CKX酶没有MnCKX1编码的CKX酶活性高。本研究通过生物信息学、不同时空表达模式以及转基因的分析,验证了MnCKX基因的功能,为以后对桑树抗逆境以及花器官方面的分子改良奠定一定的基础。