第一部分HIF-1α及其下游靶基因VEGF和GLUT-1在黑素瘤的表达目的研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和葡萄糖转运体-1(GLUT-1)在恶性黑素瘤组织和恶性黑素瘤细胞系A375,A875,KZ28中的表达,探讨HIF-1α作为黑素瘤基因治疗靶点的可能性。方法①应用免疫组织化学方法检测77例恶性黑素瘤组织HIF-1α、VEGF、GLUT-1的表达,分析其表达的相关性以及与临床病理关系,并且以20例色素痣组织作为对照研究。②应用免疫组织化学方法、Western blot方法、ELISA方法对缺氧条件下培养的A375,A875,KZ28中HIF-1α、VEGF、GLUT-1进行检测,并且以常氧条件下培养的上述细胞系作对照。结果①在77例恶性黑素瘤组织中,65例表达HIF-1α,55例表达VEGF,53例表达GLUT-1,而在20例色素痣组织2例表达HIF-1α、4例表达VEGF、3例表达GLUT-1;②在恶性黑素瘤组织中,HIF-1α与VEGF、GLUT-1的表达呈正相关;③在恶性黑素瘤组织中HIF-1α与VEGF、GLUT-1的表达与肿瘤的恶性程度相关。④HIF-1α、VEGF、GLUT-1在缺氧培养条件下的A375,A875,kZ28中表达明显高于上述三株细胞系在常氧培养条件下的表达。⑤分泌型的VEGF和膜型表达的GLUT-1随缺氧时间延长而增加,与HIF-1α表达正相关。结论①HIF-1α、VEGF、GLUT-1可作为区别良、恶性黑素细胞肿瘤的重要指标;②在黑素瘤中HIF-1α的表达影响其下游基因VEGF、GLUT-1的表达③HIF-1α是黑素瘤基因治疗的理想靶点。第二部分HIF-1α-shRNAs表达载体的构建及鉴定目的构建针对HIF-1α的发卡样shRNA真核表达载体HIF-1α-shRNA,并转染恶性黑素瘤细胞,证实其在体外培养恶性黑素瘤细胞中对HIF-1α的干扰作用及引起的效应。方法①人工合成三对互补并编码相应短发夹状HIF-1α-shRNAs的寡核苷酸链,将其插入到Pgenesil-1载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组体是否正确;②采用实时定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)、Western blot分别检测转染细胞HIF-1αmRNA和蛋白的表达变化。对其下游基因分泌型VEGF和膜型GLUT-1蛋白表达的变化分别采用ELISA和流式细胞仪检测技术;③在人恶性黑素瘤细胞系A3758中,用G418筛选沉默效果最佳的HIF-1α-shRNAs的细胞,用FCM检测GFP的表达鉴定稳定转染的单克隆细胞系;④上述稳转细胞系在缺氧情况下培养,观察其凋亡和增殖变化。结果①经酶切和测序证明HIF-1α-shRNAs序列正确;②三株MM细胞系中转染HIF-1α-shRNAs载体后,shRNA1沉默效果最佳,HIF-1αmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降(P<0.01),并在三株MM细胞系中具有平行作用,同时也可以下调VEGF和GLUT-1的表达。③荧光显微镜下观察到了G418筛选稳定表达shRNA1的A375细胞,FCM检测GFP表达均在98%以上;④稳定表达shRNA1的A375细胞在缺氧条件培养可以引起细胞凋亡和抑制细胞增殖。结论测序结果表明发卡样的HIF-1α-shRNA真核表达载体构建成功,转染A375、A875、KZ28细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭HIF-1α的表达,下调VEGF和GLUT-1的表达,筛选和鉴定出稳定转染单克隆细胞系A375在缺氧条件下可以引起细胞凋亡和抑制细胞增殖,为进一步研究HIF-1α-shRNA载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了实验基础。第三部分靶向分子TfR在恶性黒素瘤表达目的检测基因治疗靶向分子TfR在恶性黑素瘤组织和细胞系A375、A875、KZ28的表达,以明确TfR作为基因治疗的靶向分子的可能性。方法①应用免疫组织化学方法检测77例恶性黑素瘤组织TfR的表达,并且以20例色素痣组织作为对照研究。②应用免疫组织化学方法、western blot方法、流式细胞仪检测方法对常氧和缺氧条件下培养的A375,A875,KZ28中TfR表达进行检测,并且以已知低表达TfR的卵巢癌细胞系A2780进行对照。③分析在体外常氧和缺氧条件下培养的MM细胞株中TfR表达不同的可能机制。结果①在77例恶性黑素瘤组织中,70例表达TfR,而在色素痣组织只有5例表达;②在恶性黑素瘤组织中,TfR与肿瘤的病理分期相关;③在常氧培养的A375,A875,KZ28中TfR的表达分别为97%,89%,79%,A2780的表达为2%;④免疫组织化学方法、western blot方法检测恶性黑素瘤组织中TfR的表达与流式结果趋势相同。⑤缺氧在A375细胞株中对TfR的表达呈双相作用,早期表达减少,晚期表达增加。⑥缺氧对A375细胞株中对TfR的表达呈双相作用可能与缺氧早期促进凋亡,晚期引起细胞增殖有关。结论①TfR在恶性黑素瘤组织和细胞系A375,A875,KZ28明显高表达,是理想的黑素瘤基因治疗的靶向分子。②缺氧对黑素瘤细胞系TfR的表达呈双相作用,对我们个体化的利用TfR作为靶向分子提供了更加合理的理论依据。第四部分Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex对恶性黑素瘤治疗靶向性实验研究目的研究Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex在TfR高表达的黑素瘤细胞系A375以及在A375荷瘤鼠的体内模型的靶向分布,以期为下一步系统使用Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex治疗A375荷瘤鼠提供理论依据和实验数据。方法①应用FCM方法检测转染不同实验组的GFP的表达,以TfR低表达的A2780细胞系做对照。②应用Real time RT-PCR、western blot方法检测Tf-PEI-HIF-1α- shRNA complex系统治疗的A375荷瘤鼠和A2780荷瘤鼠中肿瘤组织以及重要脏器GFP的表达。结果①在体外实验中,A375组中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex转染后GFP表达到达65%,与脂质体转染相当,在A2780组中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex转染后均在5%以下。②在体内实验中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系统治疗的A375荷瘤鼠的肿瘤组织较重要脏器肝、脾、心、肾GFP的mRNA及蛋白质具有明显差异(P<0.01),在对照组A2780荷瘤鼠中肿瘤组织与重要脏器肝、脾、心、肾GFP的mRNA及蛋白质没有明显表达差异(P>0.05)。结论①Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex靶向治疗在TfR高表达的黑素瘤细胞系A375有特异性靶向分布,并且转染效率高。②在TfR高表达的黑素瘤细胞系A375荷瘤鼠中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系统靶向治疗具有肿瘤靶向特异性,为黑素瘤基因治疗研究提供了实验依据。第五部分Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex对恶性黑素瘤荷瘤鼠生物学行为影响的实验研究目的观察Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系统治疗对A375荷瘤鼠的生长抑制及可能的机制进行探讨。方法①分别对接受Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系统治疗的A375、A2780荷瘤鼠肿瘤大小进行测量,按公式(L×W2)/2计算肿瘤体积大小。②治疗结束后处死荷瘤鼠,采用免疫组化和western blot方法检测HIF-1α、VEGF、GLUT1的表达情况。③治疗结束后处死荷瘤鼠,采用免疫组化方法检测MVD;酶显色法检测肿瘤组织糖酵解产物乳酸含量。末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)定量检测两组裸鼠模型的肿瘤组织凋亡;结果①体内实验证明,实验组肿瘤生长速度也明显减慢(P<0.01)②实验组HIF-1α、VEGF、GLUT1表达明显低于对照组(P<0.01)③实验组和对照组MVD无显著性差异(P>0.05)。④实验组肿瘤组织匀浆的乳酸含量明显低于对照组(P<0.01)。⑤实验组可见大量凋亡细胞,对照组仅见少许凋亡细胞,实验组凋亡指数与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。结论①通过Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex靶向RNA干扰技术不但能阻断HIF-1α的表达,还能沉默其下游靶基因VEGF、GLUT1的表达,从而在体内可显著性抑制恶性黑素瘤生长,为恶性黑素瘤基因治疗研究提供了实验依据。②Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex抑制恶性黑素瘤生长,可能与抑制糖酵解,促进肿瘤组织凋亡有关,未发现与抑制肿瘤血管生成有关。