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第一部分小鼠Lewis肺腺癌干细胞的分离,培养和鉴定目的:从小鼠Lewis肺腺癌亲代细胞LLC-Parental中分离、培养及鉴定具有正常干细胞特征的肺腺癌干细胞模型。方法:(1)收集小鼠肺腺癌亲代细胞LLC-Parental在正常血清培养条件下悬浮生长的单个细胞,在含血清培养基中悬浮纯化8次后,分离出呈稳定悬浮球体生长的细胞,随后将其经无血清干细胞培养基传代,并连续重复5次单细胞克隆成球实验,建立稳定的LLC-SD干细胞模型。(2)体外功能实验鉴定获得的LLC-SD细胞的干细胞特性,包括RT-q PCR,软琼脂集落形成实验,96孔板单克隆形成检测,干细胞表面抗原标记物的流式细胞术检测。(3)利用BALB/c裸鼠皮下肿瘤形成实验和临床相关同源小鼠C57BL/6左肺原位种植瘤模型验证LLC-SD细胞体内成瘤及转移能力。结果:(1)RT-q PCR检测显示,LLC-SD细胞中多能干性基因Nestin,CK-18,Aldh1a1,Klf4,Nanog的表达水平显著高于LLC-P细胞。(2)采用琼脂集落形成实验和单克隆形成实验表明,LLC-SD相比LLC-Parental亲代细胞具有更强的体外软琼脂成球能力和单个细胞克隆能力,具有统计学意义。(3)LLC-SD细胞中干细胞表面抗原标记物CD133的表达量高于LLC-P细胞,具有统计学意义。(4)动物实验表明LLC-SD细胞在体内的成瘤能力及原位种植瘤转移能力均高于LLCP细胞。结论:从小鼠Lewis肺腺癌亲代细胞LLC-Parental中利用8次连续悬浮球纯化,5代连续单细胞克隆后无血清培养的方法,分离和富集具有干细胞特性的高致瘤性肺腺癌干细胞。为进一步探索肿瘤干细胞自我更新的分子机制和生物学特性奠定了基础。第二部分Nr5a2通过调控Nanog促进肺腺癌干细胞的干性和致瘤性目的:探讨Nr5a2基因在肺腺癌中对肿瘤干细胞自我更新的调控机制及其癌症生物学的特性。方法:(1)人类癌症数据库中采用医学生物信息学预测分析Nr5a2在人肺腺癌中的表达及预后情况。(2)RT-q PCR检测Nr5a2在小鼠Lewis肺腺癌干细胞LLC-SD中的表达。(3)体外功能实验验证Nr5a2促进LLC-SD细胞自我更新的能力,包括si RNAs瞬时干扰实验,CD133干细胞表面标记物流式细胞术检测,1000个细胞连续成球实验,软琼脂集落形成实验和96孔板单克隆形成实验。(4)构建慢病毒sh RNA稳定敲低Nr5a2表达系统,BALB/c裸鼠皮下肿瘤形成实验和C57BL/6小鼠左肺原位种植瘤实验验证Nr5a2对LLC-SD细胞的成瘤及原位种植瘤转移能力的影响。(5)Ch IP实验及Nanog过表达挽救实验验证Nr5a2对Nanog的直接调控作用。(6)RT-q PCR检测人肺腺癌石蜡包埋切片样品中Nr5a2和Nanog的表达水平及相关性。结果:(1)临床癌症数据库生物信息学分析结果表明,与正常肺组织相比Nr5a2在人肺腺癌组织中表达水平显著升高,并且Nr5a2表达的升高缩短肺腺癌病人的整体生存期和无进展生存期。(2)RT-q PCR结果显示,小鼠Lewis肺腺癌干细胞LLC-SD中Nr5a2的表达显著高于LLCP亲代细胞。(3)两条si RNAs从分子水平及蛋白水平均有效抑制LLCSD中Nr5a2表达,流式细胞仪检测Nr5a2瞬时干扰后,LLC-SD细胞中CD133干细胞表面标记物阳性率下降,1000个细胞连续成球率,软琼脂克隆形成率及96孔板单克隆率随Nr5a2的敲低,均显著低于LLCSD-N.C.阴性对照细胞。(4)LLC-SD细胞中Nr5a2抑制后,BALB/c裸鼠皮下成瘤实验和C57BL/6小鼠左肺原位种植瘤实验表明Nr5a2的高表达促进LLC-SD细胞体内的成瘤及转移的能力,并且降低C57BL/6小鼠的生存率。(5)Ch IP实验结果表明,Nr5a2通过与Nanog的直接相互作用调控Nanog的表达,同时Nr5a2抑制后过表达Nanog恢复了LLC-SD体外的自我更新表型,进一步验证了Nr5a2通过直接调控Nanog促进LLC-SD自我更新。(6)临床样本结果显示,晚期肺腺癌患者的Nr5a2和Nanog表达明显高于早期患者,并且Nanog与Nr5a2的表达呈显著正相关。结论:Nr5a2可通过直接调控Nanog的表达促进肺腺癌干细胞的干性和致瘤性。第三部分Cdh1作为癌基因通过PI3K和MAPK信号通路促进肺腺癌干细胞的自我更新目的:探讨Cdh1作为促癌基因在肺腺癌干细胞中的调控机制。方法:(1)利用多个人类癌症数据库分析Cdh1在多种癌症包括人肺腺癌中的表达及预后情况。(2)RT-q PCR检测Cdh1在小鼠Lewis肺腺癌干细胞LLC-SD中的表达情况。(3)利用si RNA瞬时干扰实验,软琼脂克隆形成实验和96孔板单克隆成球实验等功能实验,验证Cdh1对LLCSD细胞体外自我更新能力的影响。(4)慢病毒sh RNA表达系统的构建可稳定敲除Cdh1,BALB/c裸鼠皮下成瘤实验和C57BL/6同源小鼠左肺原位种植瘤实验验证Cdh1对LLC-SD细胞在体内的成瘤及转移能力的影响。(5)采用多个数据库整合生物学信息分析,包括PPI,GO,GSEA等预测Cdh1在肺腺癌中相关的信号转导通路及其潜在调控机制。(6)使用RT-q PCR,Wb分别用于检测LLC-P和LLC-SD细胞中预测的信号传导途径的表达情况。CCK-8增殖实验检测LLC-P和LLCSD细胞中起主要增殖调控的信号通路,采用抑制剂阻断及si RNA瞬时干扰LLC-SD中高调的信号通路,观察LLC-SD细胞中Cdh1及其多种多能干性基因的表达差异。体外功能实验测定,如软琼脂集落形成实验及96孔板单克隆成球实验验证信号通路介导的Cdh1在LLC-SD细胞中的调控机制(7)构建慢病毒sh RNA表达系统阻断相关信号通路,BALB/c裸鼠皮下成瘤实验和C57BL/6小鼠左肺原位种植瘤实验验证信号通路介导的Cdh1表达变化对LLC-SD细胞在体内的成瘤及肿瘤转移能力的影响。结果:(1)生物信息学分析表明Cdh1在多种癌症包括人肺腺癌中显著高表达,在肺腺癌晚期病人中Cdh1的表达显著高于早期病人,并降低肺癌病人的整体生存期,无进展生存期和进展后生存期。(2)RT-q PCR检测结果表明Cdh1在小鼠Lewis肺腺癌干细胞LLCSD中的表达水平显著高于LLC-P细胞。(3)si RNA有效抑制Cdh1的表达,软琼脂克隆形成实验LLC-SD-si Cdh1实验组中的软琼脂克隆成球率显著低于LLC-SD-N.C.对照组。96孔板单克隆形成实验表明Cdh1受si RNA干扰后,LLC-SD细胞单细胞克隆球的形态变得松散不规则,并且单细胞克隆率显著低于对照细胞。(4)BALB/c裸鼠皮下肿瘤形成实验和C57BL/6小鼠左肺原位种植瘤实验表明Cdh1的高水平表达促进LLC-SD细胞在体内的成瘤及转移的能力。(5)数据库整合分析结果预测出PI3K和MAPK转导通路是人肺腺癌中Cdh1最相关富集的调控信号通路。(6)RT-q PCR和Wb检测结果显示在LLC-SD细胞中,MAPK信号通路相关的Mapk1,Mek1和Eif4e的表达明显上调,而在LLC-P细胞中,PI3K信号通路相关的PI3K,Akt和Mtor的表达显著升高。CCK-8实验表明PI3K信号通路在LLC-P细胞增殖中起主要调控作用,而MAPK信号通路在LLC-SD细胞中起主要调控作用。LLCSD细胞中抑制剂LY294002阻断PI3K途径后,多能干性基因如Cdh1,Nanog,Nr5a2和Tbx3等表达明显下调,而抑制剂PD98059阻断MAPK通路后Cdh1及多能干性基因Sox2,Nanog,CD133,Aldh1a1,Nr5a2和Tbx3表达显著升高。抑制剂分别有效阻断PI3K和MAPK信号通路后,相比对照组,LLC-SD-LY294002组与LLC-SD-PD98059组细胞的单细胞克隆率均显著降低,但LLC-SD-LY294002组细胞单细胞克隆球的形态变得松散不规则,LLC-SD-PD98059组单细胞克隆球的结构变得紧实致密。si RNA有效阻断PI3K和MAPK信号通路后,软琼脂克隆形成实验和96孔板单克隆形成实验中LLC-SD-sip110和LLC-SDsi Mek1/2实验组的克隆成球率均显著低于LLC-SD-N.C.对照组。但96孔板单克隆形成实验中LLC-SD-sip110组单细胞克隆球的形态变得松散不规则,LLC-SD-si Mek1/2实验组单细胞克隆球的结构变得紧实致密。与抑制剂结果相一致。(7)BALB/c裸鼠皮下成瘤实验和C57BL/6小鼠左肺原位种植瘤实验验证Cdh1通过PI3K和MAPK转导通路介导的调控机制,在体内促进LLC-SD细胞的成瘤及转移的能力。结论:Cdh1被PI3K信号通路正向调控及MAPK信号通路负向调控,并且作为癌基因在体外和体内促进肺CSCs的自我更新。