研究背景：脊髓损伤(SCI)多发于20-40岁中青年人群。统计显示：我国的脊髓损伤患者多达百万人,以交通事故,各种生产事故,运动损伤造成的脊髓损伤为主,其中由于交通事故造成的脊髓损伤达7万以上,由于各种生产事故及运动损伤造成的脊髓损伤达5万以上。并且,据一份最新调查表明,近年来我国脊髓损伤发病率呈现逐年增高趋势,调查结果显示：脊髓损伤发病率为6.7/100万人口。其中,交通事故是导致脊髓损伤的首要原因,占全部脊髓损伤人数的46.9%。其次是坠落、砸伤、挤压等所致,占33.1%。SCI严重影响患者的运动功能。SCI引起了一系列细胞因子介导的炎症反应,包括肿瘤坏死因子(TNF-a)、白介素-6(IL-6)、IL-β等,并且这些因子导致二次损伤。以前的研究表明：SCI后TNF-a、 IL-6、IL-β等的mRNA基因表达显著上调。酪氨酸激酶(JAK)及信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路的激活是信号从细胞表面传到细胞核的重要途径,细胞膜JAK激活导致STAT在细胞质磷酸化,信号由磷酸化的STAT传导至细胞核,接着靶基因转位,这在SCI后病理生理变化起重要的作用。JAK/STAT信号通路是与细胞的生长,生存,发展和分化密切相关的信号转导通路。作为真核生物的一种进化保护途径,在以前的中枢神经系统损伤中已有相关报导。JAK/STAT信号通路与脊髓损伤区域的神经生长和胶质瘢痕形成具有直接关系。轴突损伤后,STAT3的激活和过度表达对神经元保护具有重要意义。JAK/STAT信号通路是细胞内信号转导通路,涉及两蛋白家族的活化：即Janus激酶(JAK)和信号转导与转录激活因子(STAT)。JAK激酶是非受体型蛋白酪氨酸激酶家族。激酶包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2;STAT家族包含七个转录因子STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6。JAK/STAT信号通路是一个调节基因表达的一个主要有效调整系统。这一通路包括由生长因子、激素或细胞因子等多肽对细胞膜受体的激活,从而引起细胞膜中JAK的激活。蛋白酪氨酸磷酸化是一个由生长因子或细胞因子调节的重要的生化机制,最初,JAKs通过与细胞膜受体结合发生酪氨酸磷酸化。随后,通过酪氨酸磷酸化激活细胞质中的STATs[6-9],进而STATs二聚体易位到细胞核,在细胞核内它们绑定到特定的顺式作用元件,导致不同的靶基因的转录。STAT信号通路在周围神经损伤的作用已被广泛研究,在小鼠面神经,舌下神经损伤后再生研究中,使用原位杂交技术及半定量聚合酶链反应技术发现：JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT3、STAT5的mRNA短暂增加,只有STAT3显著增加并持续。周围神经损伤同时激活脊髓背侧小胶质细胞的JAK/STAT通路。在SCI研究中,SCI后STAT3信号通路在星形胶质细胞增生及神经胶质细胞瘢痕形成过程中起重要的作用。Okada et al[11-13]证实：在SCI后运动功能恢复及损伤组织修复过程中,STAT3在调节星形胶质细胞反应性中起关键作用。免疫印迹表明：SCI后6小时各种细胞的JAK1/STAT3通路被显著激活,在急性期,神经元的STAT3磷酸化有助于SCI后的神经保护,而在慢性阶段则是小胶质细胞及星形胶质细胞STAT3磷酸化而激活。研究表明[16-20]STAT1与脊髓神经元的死亡,脊髓局部缺血等密切相关,但其机制仍未完全明确。脊髓损伤可由原发性和继发性因素共同引起,严重损害患者的生活质量。在原发性脊髓损伤中,在很短的时间内脊髓发生不可逆性损伤,而继发性脊髓损伤则涉及一系列的病理改变,包括局灶性组织缺血,水肿和炎症。在心肌缺血再灌注损伤中,发现STAT1激活引起细胞凋亡,而且STAT1在大脑缺血后被激活,引起大脑缺血性损伤。其机制是抑制P13-激酶/AKT通路的神经保护作用并使凋亡受体Fas表达增加。自由基清除剂及抗氧化剂保护心肌细胞及脑组织,对抗缺血再灌注损伤的机制是：自由基清除剂及抗氧化剂有效抑制STAT1的磷酸化,STAT1缺失大鼠表现出大脑缺血体积的减少,而且STAT1缺失的细胞能够抵抗TNF-a或IL-B介导的细胞凋亡[22-25],依据这些研究结果,本实验提出神经凋亡可能由于SCI后STAT1的激活引起。氧化损伤是许多疾病的病因,包括：帕金森病、老年痴呆症、脊髓侧索硬化症等,这些氧化应激伴随着JAK/STAT通路的激活,也有报道[26-28]在蛛网膜下腔出血时氧化应激伴随着STAT1的激活,这些研究表明JAK1/STAT1信号通路可能诱导氧化应激反应并与SCI后神经元死亡有关。在脑缺血后神经元JAK1/STAT3信号通路被激活,STAT3通过神经保护基因bcl-2在神经保护中起重要作用,抑制STAT3可以增加脑梗死的面积。前期研究提示[29-32]：抑制白介素-6导致STAT3磷酸化减少而加重大脑缺血,激活STAT3增加了缺血心肌的存活。STAT3缺陷大鼠表现出脑梗死面积增大以及心肌缺血再灌注损伤后心脏功能的降低。JAK1/STAT3激活有助于神经保护。STAT1基因敲除或STAT1抑制后,目的SCI后存在时间依赖性的JAK/STAT信号通路的激活,脊髓损伤与JAK/STAT表达变化具有相关性,因此对脊髓损伤后JAK/STAT通路的的研究具有重要意义,本研究应用大鼠急性脊髓损伤模型,采用免疫印迹分析检测脊髓损伤后脊髓组织中不同时间点JAK1与STAT1的表达变化,并且采用STAT1抑制剂及STAT1siRNA干预方式,腹腔注射STAT1抑制剂或STAT1siRNA,观察其对损伤脊髓组织中不同时间点JAK1与STAT1活性的影响,各种炎症因子表达的变化、凋亡相关蛋白表达、行为学评分、脊髓脱髓鞘、组织学分析等,探讨STAT1阻断或抑制在脊髓损伤早期的作用,为临床治疗提供理论依据。方法1.对大鼠进行脊髓损伤模型建立,在手术后随机分为Sham组、SCI组、STATlinhibitor组,采取分级运动评分检测运动功能,HE检测脊髓损伤程度。2.对大鼠进行脊髓损伤模型建立,在手术后随机分为Sham组、SCI组、STATlinhibitor组,应用Western blot及免疫荧光法检测JAK1/STAT1磷酸化水平；ELISA检测炎症因子变化；TUNEL染色进行脊髓组织形态学研究。3.对大鼠进行脊髓损伤模型建立,在手术后随机分为Sham组、SCI+controlsiRNA组、SCI+STAT1siRNA组。采取分级运动障碍检测,HE检测脊髓损伤程度；ELISA检测炎症因子变化；尼氏染色检测脊髓前角运动神经元情况。Western blot检测细胞凋亡情况及脊髓脱髓鞘情况。结果1.病理切片证实,脊髓发生撞击性损伤,术后大鼠双侧后肢运动能力丧失,TNF-a、IL-6、IL-β表达减少,缺血再灌注损伤减少,细胞耐缺血能力增加。SCI后STAT1时间及空间的改变以及SCI后STAT1的作用目前仍未完全阐明,本实验采用免疫印迹分析检测脊髓损伤后脊髓组织中不同时间点JAKl与STAT1的表达变化,并且采用STAT1抑制剂及STAT1siRNA干预方式,观察其对损伤脊髓组织中不同时间点JAK]与STAT1活性的影响,各种炎症因子表达的变化,行为学评分,脊髓脱髓鞘,细胞凋亡等探讨STAT1抑制在脊髓损伤早期治疗中的作用,为临床治疗提供理论依据。大鼠脊髓损伤模型建立成功。随着时间的延长,两组的运动功能得到了一定的恢复,就SCI组与STAT1inhibitor组比较,STAT1inhibitor组的运动功能在术后每个检测点均高于SCI组。2.CBS评分检测结果与BBB评分相类似,两组均随时间的延长,综合功能得到了一定的恢复,就SCI组与STAT1inhibitor组比较,STAT1inhibitor组的肢体感觉与神经反射功能在术后每个检测点均高于SCI组。3.发现SCI后,p-JAK1与p-STAT1水平随着时间推移,表达量逐渐增高,并在48小时到达了高峰。而JAK1与STAT1的总蛋白水平则变化不大。免疫荧光方法进行检测,结果也与Western blot相同。4.发现SCI组与Sham组比较,髓过氧化物酶(MPO)浓度有显著的升高,而在STAT1inhibitor组的MPO浓度较SCI组有明显的降低。并且对促炎症细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达检测及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的表达也与MPO有类似的变化。5.对大鼠脊髓损伤的组织形态学检测,SCI组能够看到有明显的白质水肿现象,而进行了STAT1siRNA干预后,能够看到组织形态上有明显的好转,白质水肿明显减少。6. TUNEL法检测能够发现SCI组凋亡阳性细胞较Sham组比较有显著的升高,STAT1抑制剂的干预后能够明显减少脊髓组织中细胞的凋亡。7.发现STAT1siRNA干预能够明显降低SCI所引起的TNF-α、IL-1β及IL-6的浓度升高的情况,而IL-10的浓度变化则与上述几个细胞因子相反。8.通过Western blot检测,能够看到STAT1siRNA干预能够显著降低STAT1蛋白的表达,SCI+controlsiRNA组的核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白表达显著升高,而加入了STAT1siRNA后NF-κBp65蛋白的表达又能够被明显遏制。SCI+controlsiRNA组的Bcl-2蛋白表达显著降低,而加入了STAT1siRNA后,Bcl-2蛋白表达水平有了明显的升高。而Bax蛋白表达则相反。9.通过尼氏实验发现SCI组脊髓前角运动神经元数量丢失明显,而STAT1siRNA干预后运动神经元的数量丢失明显减少。10.通过Western blot检测,Sham组髓鞘相关抑制因子MAG及Nogo-A的表达水平较低,而在SCI+controlsiRNA组则有明显的升高,经过STAT1siRNA干预后,上述因子的表达有了明显的下降。结论1.脊髓损伤后大鼠运动能力受损,JAK1/STAT1信号通路参与了脊髓损伤的发展。2.脊髓损伤后JAK1/STAT1信号通路的激活能够诱发促炎因子释放、神经元细胞凋亡及髓鞘脱失,从而加重脊髓损伤。3.脊髓损伤后,对JAK1/STAT1信号通路进行阻断能有效逆转继发性脊髓损伤,这一重要发现有助于临床上对于脊髓损伤的治疗。