研究目的:建立稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞系及进行体外和体内验证,在动物水平对细胞的成瘤性能、发光能力进行评价,建立人类肿瘤动物模型,为后续在动物体内进行抗肿瘤药物研究奠定基础。方法:用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切PGL3-Promoter真核表达载体,将得到的luciferase基因片段连接到pRC/CMV₂载体上,构建PRC/CMV₂-luc⁺重组质粒。脂质体介导法将pRC/CMV₂-luc+质粒转染A549细胞,并经G418筛选获得A549- luc⁺单细胞克隆,挑选出克隆细胞不断传代并扩大培养,在传代过程中维持G418筛选,通过荧光素酶活性测定逐步淘汰活性较低的克隆细胞,保留活性高并且稳定表达luciferase的克隆细胞株。在体外利用活体成像系统评价其稳定发光能力,检测发光强度与细胞数量之间的相关性。分别提取稳定表达荧光素酶克隆细胞株、低表达的细胞株以及A549母细胞的总RNA,逆转录后RT-PCR检测luciferase的表达差异。提取稳定高表达luciferase的克隆细胞株的基因组DNA,PCR检测荧光素酶基因是否成功整合到A549细胞的基因组;将得到的稳定表达luciferase的A549-luc⁺细胞皮下接种裸鼠,利用活体成像系统监测肿瘤的生长情况,并检测其发光能力强弱,每隔4天成像检测一次。观察五周后处死小鼠,切取移植瘤福尔马林液固定,石蜡包埋后切片,HE染色,光镜观察。结果:1.构建的PRC/CMV₂- luc⁺真核表达质粒双酶切后,琼脂糖凝胶电泳得到分子量大约为1.7kbp和5.5kbp的两条条带,证实重组质粒构建成功。2.质粒转染A549细胞后,经G418筛选和单克隆的连续传代后获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆。活体成像系统检测证实其发光强度与细胞数有较好的线性关系（相关系数为0.99）。3.提取稳定克隆的基因组DNA后,PCR扩增得到250bp的特异扩增产物,与设计的luciferase引物扩增片段大小相符。荧光定量PCR检测发光强度不同的两株细胞荧光素酶基因的表达,确定荧光素酶活性较高的A549-luc+ clone7细胞中luciferase基因表达量是活性低的A549-luc+ clone8细胞的2^4.95倍,与体外检测到的luciferase活性水平一致。4.该细胞株皮下接种裸鼠形成接种瘤的发光强度与肿瘤的生长正相关。5.肿瘤组织的病理切片HE染色显示接肿瘤符合肺腺癌组织特征结论:成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的A549细胞系,体外和活体检测证实该细胞系具有稳定的发光能力;而且其发光强度与细胞的数量和裸鼠接种瘤的生长呈正相关。为活体水平动态监测该细胞成瘤后肿瘤的生长以及观察药物对肿瘤的干预提供了一个新的途径。