铊(thallium,Tl)是一种剧毒重金属,在地球上主要以伴生元素分布于黄铁矿、闪锌矿等矿物中,然而铊在自然界中的含量很低,低于μg/g水平,所以,人们对铊的关注度一直不高。随着近几十年来我国工业的快速发展,在众多的工业活动,如燃煤、水泥制造和有色金属冶炼等过程,均会产生大量含有铊的灰分和废气,排放至大气中导致空气中铊水平增加。高剂量铊的接触可对人体神经系统、心脏、肝脏和肾脏等组织造成急性损伤,严重者可致死亡。此外,有研究表明,急性高浓度铊暴露可导致肺组织出现肺炎等病理变化,而横断面研究未发现低剂量金属铊暴露与肺功能损伤之间有显著关联性。肺功能进行性下降是诊断慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要评价依据,根据肺功能下降速度可早期发现高风险患病人群,以便及早开展有效的预防干预措施,因此,有必要在前瞻性队列研究中探索金属铊暴露与肺功能降低之间的关联性。据估计,肺部疾病发生的风险70%~90%来自于环境因素。随着人类基因组计划及人类基因组单体型图计划的完成,科学家们发现遗传因素是影响人类绝大多数复杂性和慢性疾病的重要病因,并且可与环境因素共同作用,影响疾病的发生发展。众所周知,吸烟及其产生的烟雾是引起肺功能下降、引发COPD最主要的环境因素。越来越多的研究表明金属污染物与肺功能降低之间存在明显的关联性,且吸烟可增强该关联性。最近的一项关于中国肺部健康研究的流行病学调查结果显示,只有13.7%的吸烟人群罹患COPD,说明个体遗传背景的差异可影响机体患病的易感性。因此,进一步探索金属铊暴露与吸烟和基因遗传变异的交互作用对肺功能损伤的影响,将有助于揭示金属铊的肺部损伤效应和机制。基于上述研究背景,本研究选取某焦化厂职工为研究对象,在2010年10月份完成了1628名工人的基线资料的调查、肺功能的测定和血液及尿液的收集工作,并于2014年10月进行了第一次随访,在上述人群中共有1243名工人获得随访信息,包括基本信息的获取、尿样的收集及肺功能测定的结果等。将研究个体的基线肺功能水平和随访后的肺功能水平做差即可得到随访的1243名工人4年间的肺功能降低值。此外,我们测定了该人群基线时(2010年)尿中金属铊的含量,并采用Illumina基因芯片对该人群外周血DNA进行了全基因组分型。接着,本文主要进行了如下内容的研究:(1)我们采用多元线性回归模型探究基线尿铊水平与肺功能降低程度之间的关联性;为进一步了解铊暴露致肺功能损伤的潜在机制,我们对这1243名研究对象进行筛选,从满足筛选标准的1185名工人中以40%的比例随机抽取了474人,随即测定这474人的基线尿铊水平和血浆C反应蛋白(C–reactive protein,CRP)含量,并分析尿铊水平与血浆CRP水平之间的相关性;(2)我们根据研究对象基线调查时的吸烟状态和吸烟程度进行分层,探索基线尿铊水平和吸烟状态/吸烟强度的交互及联合作用与肺功能降低之间的关联性,同时分析不同吸烟状态/吸烟强度及铊暴露人群体内血浆CRP水平的分布;(3)我们从基因芯片分型结果中提取80个细胞凋亡通路基因上下游5 kb区域包含的540个遗传多态性位点,探讨尿铊水平和凋亡基因多态性的交互作用与肺功能降低程度的关联性。为了解筛选出的遗传多态性位点的生物学功能,我们进一步在基因型–组织表达(genotype–tissue expression,GTEx)公共数据库中分析基因多态性与正常肺组织中相应基因表达水平的关联性。本论文主要包括三部分:第一部分焦炉作业工人金属铊暴露与肺功能降低的前瞻性队列研究目的:探讨焦炉作业工人的基线金属铊暴露水平与4年间肺功能降低程度的关联性。方法:本研究选取某焦化厂职工为研究对象,以2010年10月纳入的1628名工人为基线研究对象,2014年10月对该人群开展了随访工作,其中有1243名工人随访成功。在基线和随访两次调查中均采用问卷调查的方式收集研究人群的一般人口学特征、吸烟饮酒情况及既往史等信息,并采集研究人群的清晨空腹外周血及尿液。本课题组分别采用电感耦合等离子质谱联用仪和气相色谱–质谱联用仪对研究对象的基线(2010年)尿中金属铊含量及尿中10种多环芳烃代谢物水平进行了测定;研究对象的基线和随访时的实际用力肺活量(forced vital capacity,FVC)和第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in one second,FEV1)水平均通过肺功能仪测定直接获得;此外,根据受试者的年龄、性别、身高和体重等信息,通过肺功能仪自动计算获得FVC实测预测比(the percentage of predicted FVC,pp FVC)和FEV1实测预测比(the percentage of predicted FEV1,pp FEV1)水平。我们采用多元线性回归模型,在基线纳入的1628名工人中分析了基线尿铊水平与基线肺功能水平之间的横断面关联;同时,在成功随访的1243名工人中分析基线尿铊水平与4年间肺功能降低程度之间的关联性,上述采用的多元线性回归模型均校正了吸烟状态、饮酒状态、锻炼情况、性别、年龄、尿中总多环芳烃代谢物水平(the sum of monohydroxy polycyclic aromatic hydrocarbons,ΣOH–PAHs)、身体质量指数(body mass index,BMI)及腰臀比等混杂因素。我们从1243名的研究对象中随机抽取50人,测定他们基线和随访两个时间点的尿铊含量,通过计算组内相关系数(intraclass correlation coefficient,ICC)评价4年间尿铊水平的稳定性;此外,我们从研究对象中随机抽取474人,用酶联免疫吸附法检测其基线血浆CRP含量,分析基线尿铊与血浆CRP水平之间的相关性。结果:与2010年的肺功能水平相比,研究对象在2014年的肺功能指标FVC、pp FVC、FEV1及pp FEV1水平均出现了明显降低(所有P<0.001)。横断面的研究结果提示,基线尿铊水平与上述四项基线肺功能指标水平均无显著关联性(所有P>0.05)。前瞻性队列研究的结果显示,基线尿铊水平与FEV1降低程度有明显的剂量–效应关系(P=0.025):基线尿铊水平增加至原来的2倍时,FEV1降低幅度增加29.81 m L。我们根据研究对象的基线尿铊水平的第25位百分位数、第50位百分位数及第75位百分位数,进一步将1243名工人分为4组,分析后发现:与尿铊水平≤0.073μg/mmol肌酐的低铊暴露组人群(包括Q1、Q2和Q3组)相比,尿铊水平>0.073μg/mmol肌酐的高铊暴露组人群(Q4组)的FEV1降低幅度明显增加[β(95%CI)=71.08 m L(13.12,129.04),P=0.016]。随机选取的50名工人的基线和随访两个时间点的尿铊水平的ICC(95%CI)为0.444(0.192~0.641,P=0.001)。在随机抽取的474名工人中,尿铊水平与血浆CRP水平存在显著正相关(P<0.05),且高铊暴露组人群(尿铊水平>0.073μg/mmol肌酐)的血浆CRP浓度明显高于低铊暴露组人群的含量(尿铊水平≤0.073μg/mmol肌酐)(P=0.006)。结论:前瞻性队列研究提示,金属铊暴露可导致肺功能指标FEV1水平显著降低,为金属铊的肺部毒性作用提供了流行病学证据。同时尿铊水平与机体系统炎症反应标志物CRP具有明显的正相关关系,提示金属铊的暴露导致的机体炎症反应可能在铊引起肺功能损伤中发挥作用,但其潜在的生物学毒性机制还需要深入的探究。第二部分金属铊暴露和吸烟的交互作用与肺功能降低的关联性分析目的:探讨金属铊暴露与吸烟的交互及联合作用对肺功能降低的影响。方法:根据第一部分研究对象的基线吸烟状态,将1243名焦化厂工人分为从不吸烟人群和吸烟人群(包括曾经吸烟人群和目前吸烟人群),结合基线尿铊水平,采用多元线性回归模型分析尿铊水平与吸烟状态的交互及联合作用对肺功能降低的影响。我们还采用吸烟的包年(=吸烟年数×每日吸烟支数/20)来评价吸烟人群的累积吸烟强度,并以包年的中位数(15包年)将吸烟人群分为轻度吸烟组人群(<15包年)和重度吸烟组人群(≥15包年),继而分析尿铊水平和吸烟强度的交互及联合作用与肺功能降低的关联性。此外,基于第一部分测得的474名工人体内CRP水平的结果,进一步比较不同吸烟状况/吸烟强度及不同尿铊水平暴露组人群中血浆CRP水平的差异。结果:吸烟组人群和从不吸烟组人群随访时的肺功能指标FVC、pp FVC、FEV1及pp FEV1水平均明显低于他们基线时相应的肺功能指标水平(所有P<0.05);且重度吸烟组人群FVC和FEV1降低幅度明显高于从不吸烟组人群的降低幅度(所有P<0.05)。尿铊与吸烟状态和吸烟强度在影响pp FEV1降低程度上均具有明显的交互效应(Pint分别为0.039和0.034)。根据吸烟状态及吸烟强度情况将研究对象进行分层分析,结果显示,在吸烟组人群中,尿铊浓度增加至原来的2倍时,4年间FEV1的降低值增加31.91 m L(95%CI:5.31~70.52,P<0.05)。在重度吸烟组人群中,尿铊浓度增加至原来的2倍时,FEV1和pp FEV1的降低值分别增加56.42 m L(95%CI:9.66~103.19)和1.63%(95%CI:0.14~3.11)。分析尿铊水平与吸烟的联合作用,发现与低尿铊水平暴露的从不吸烟人群相比,高尿铊水平暴露的重度吸烟人群的FEV1和pp FEV1降低值分别高158.44 m L(95%CI:54.88~262.00,P=0.003)和4.58%(95%CI:1.40~7.76,P=0.005)。与低尿铊水平暴露的从不吸烟人群相比,高尿铊水平暴露的重度吸烟人群体内血浆CRP含量明显增加,且在六组人群中含量最高(2.18 mg/L vs.1.01 mg/L,P=0.008)。结论:吸烟状态和吸烟强度与金属铊暴露对ppFEV1降低存在明显的交互作用,高尿铊水平暴露的重度吸烟人群的4年间FEV1和pp FEV1降低幅度显著高于低尿铊水平暴露的不吸烟人群,提示吸烟与金属铊在影响肺功能水平上具有联合效应,同时高尿铊水平的重度吸烟人群的血浆CRP水平最高,提示金属铊暴露与吸烟可能通过共同增加机体炎症反应水平产生加重肺功能损伤的联合作用,然而具体的生物学机制有待进一步探索。本研究为环境–环境交互作用对肺功能损伤的影响提供了研究证据。第三部分金属铊暴露和凋亡通路基因多态性的交互作用与肺功能降低的关联性目的:在第一部分的前瞻性队列研究中,我们发现随着金属铊暴露水平的提高,个体4年间的肺功能指标FEV1显著降低。从毒理基因组学比较数据库(comparative toxicogenomics database,CTD)中可知,目前已发表的与铊或含铊化合物有关的基因共56个,其中有16个富集在细胞凋亡通路上,因此,在本部分的研究中,我们进一步探究金属铊暴露与凋亡通路基因多态性的交互作用对FEV1降低程度的影响,筛选金属铊暴露致肺功能损伤的易感人群。方法:在上述队列研究的人群中,我们采用Illumina基因芯片对外周血DNA进行全基因组分型,芯片类型为Global Screening Array–24 Multi–Disease Bead Chip Array(GSA–MD)。从分型的结果中,我们选取来源于KEGG凋亡通路位于常染色体上的80个基因,对其上下游5 kb区域内所有双等位基因标签单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的分型结果进行提取。删除基因分型缺失率≥10%的样本,删除基因分型失败率≥5%、哈迪–温伯格平衡P值<10–6或最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)<0.05的SNP位点,最终纳入540个SNPs位点进行后续分析。采用多元线性回归,校正性别、年龄、BMI、腰臀比、吸烟和饮酒状态、锻炼状态、尿ΣOH-PAHs及基线FEV1水平,分析尿铊水平和上述凋亡通路基因SNPs的交互作用对FEV1降低值的影响,筛选出与尿铊水平具有显著交互作用的阳性SNPs位点。为探索上述阳性位点对相应基因表达水平的影响,我们进行了表达数量性状基因座(expression Quantitative Trait Loci,e QTL)分析,分别采用GTEx数据库分析正常肺组织中阳性SNPs位点与基因表达水平之间的相关性。随后进一步在SNP不同基因型人群中分析尿铊水平与FEV1降低值的关联性。结果:分析发现,凋亡通路基因中的12个SNPs对金属铊暴露与FEV1降低程度之间的关联性存在显著的交互作用(Pint<0.01)。对上述SNP位点进行e QTL分析,发现在正常肺组织中,随着rs7373858 A等位基因数和rs113420705 C等位基因数的增加,IRAK2和CASP3基因的表达水平逐渐提高(Ptrend分别为0.035和1.30×10–4);在IRAK2–rs7373858 GA+AA基因型携带人群中,尿铊浓度的增加与FEV1降低程度之间存在显著正关联性[β(95%CI)=45.36 m L(18.20~72.54),P=0.001];在CASP3–rs113420705 CC基因型携带人群中,尿铊浓度增加值至原来的2倍时,FEV1降低程度增加74.35 m L(95%CI:24.78~123.91,P=0.003);在IRAK2–rs7373858 GG基因型携带人群、CASP3–rs113420705 TT基因型携带人群中,尿铊水平与FEV1降低之间均无显著关联(所有P>0.05)。随着rs4647601 A等位基因数的增加,CASP3基因的表达水平逐渐降低(Ptrend=5.50×10–7);在CASP3–rs4647601 CC基因携带人群、CA基因型携带人群及AA基因型携带人群中,尿铊与FEV1降低值之间均未见显著关联性(所有P>0.05)。与携带rs7373858 GG基因型且低尿铊水平暴露组人群相比,携带rs7373858 GA+AA基因型且高尿铊水平暴露人群的4年间FEV1降低值增加92.00 m L(95%CI:1.60~182.40,P=0.046)。与携带rs113420705 TT基因型且低尿铊水平暴露人群相比,携带rs113420705 CC基因型且高尿铊水平暴露人群的4年间FEV1降低值增加117.82 m L(95%CI:–8.00~243.65,P=0.067)。结论:IRAK2基因内含子区的rs7373858和CASP3基因5′UTR的rs113420705位点对金属铊暴露与FEV1降低值之间的关联性均存在显著的交互效应,且rs7373858A等位基因和rs113420705 C等位基因对金属铊暴露与FEV1降低值之间的关联性均具有明显的联合作用。e QTL分析发现rs7373858 C等位基因数和rs113420705 C等位基因数可分别显著提高IRAK2和CASP3基因表达水平,提示凋亡基因IRAK2和CASP3可能参与了铊暴露致肺损伤毒作用过程。本部分不仅为环境–基因交互作用对肺功能损伤的影响提供研究证据,也为金属铊致肺部损伤的生物学机制提供了研究线索。