第一部分铜绿假单胞菌生物膜对中性粒细胞免疫逃逸及机制研究目的:由于机械通气在新生儿的广泛应用和气管导管（Endotracheal tube,ETT）极易形成细菌生物膜（biofilm,BF）,其所并发的呼吸机相关性肺炎依旧是目前临床上比较棘手的问题。本课题组前期研究发现,铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）是新生儿ETT表面最常见的细菌之一,P.aeruginosa在ETT又极易形成BF,且国内外研究发现,中性粒细胞（polymorphonuclears,PMNs）与P.aeruginosa BF在体内的形成、发展以及致病性都有密切关系,但其对黏液型P.aeruginosa BF的作用及机制尚不清楚。因此,本研究的目的在于探讨活化的PMNs及其氧化爆发的主要产物H₂O₂对黏液型P.aeruginosa FRD1 BF的影响及其机制。方法:将黏液型P.aeruginosa FRD1 BF培养分为FRD1组（对照组）、FRD1+PMNs组、FRD1+1 mM H₂O₂组和FRD1+2 mM H₂O₂组,分别用ddH₂O、PMNs、1 mM H₂O₂、2 mM H₂O₂处理FRD1生物膜。结晶紫、稀释平板计数观察PMNs或者H₂O₂对黏液型P.aeruginosa的细菌黏附能力的影响;稀释平板计数、激光共聚焦（CLSM）观察PMNs或者H₂O₂对黏液型P.aeruginosa BF形成的影响;稀释平板计数、激光共聚焦（CLSM）观察PMNs或者H₂O₂对黏液型P.aeruginosa成熟BF的影响;盐酸硼酸法观察PMNs或者H₂O₂对黏液型P.aeruginosa BF胞外基质藻酸盐的影响;RT-PCR检测藻酸盐相关基因algD、algR、algU的表达;观察PMNs或者H₂O₂对黏液型P.aeruginosa BF胞外基质藻酸盐相关基因的影响。结果:实验结果显示PMNs或者H₂O₂能增强黏液型P.aeruginosa细菌的黏附能力（P<0.05）和BF的形成（P<0.05）。PMNs或者H₂O₂处理组的BF内活菌数和BF厚度均明显高于FRD1单独组（P<0.05）。与FRD1单独组比较,PMNs或者H₂O₂处理组的BF藻酸盐含量明显增加（P<0.05）,且藻酸盐相关基因algD、algR、algU的表达也不同程度的增加。结论:PMNs作为机体抵抗细菌感染的主要固有免疫细胞之一,活化的PMNs或者其活化后的主要产物之一H₂O₂不但不能清除黏液型P.aeruginosa BF,反而能增强黏液型P.aeruginosa FRD1的黏附能力和BF的形成,也能促进黏液型P.aeruginosa BF胞外基质藻酸盐的产生以及藻酸盐相关基因的表达,从而增强细菌对机体固有免疫的逃逸作用。这可能是黏液型P.aeruginosa BF持续慢性感染的原因之一,以阻断PMNs持续的活化为靶点将成为控制黏液型P.aeruginosa BF感染新的思路。第二部分野生型铜绿假单胞菌生物膜对单核巨噬细胞的免疫逃逸及机制研究目的:第一部分已经证实黏液型P.aeruginosa能够利用活化的PMNs或者其活化的主要产物H2O2增强自身的黏附能力和BF的形成,从而增强自己对机体固有免疫细胞的免疫逃逸作用。固有免疫细胞是机体抵御细菌感染的第一道防线,其中PMNs和单核巨噬细胞是固有免疫细胞中最主要的两种细胞。有研究表明,P.aeruginosa浮游细菌能使机体单核巨噬细胞产生炎症小体,从而降低机体对细菌的清除能力。那么,P.aeruginosa BF能否引起单核巨噬细胞产生炎症小体,从而达到对机体的免疫逃逸作用呢?其具体机制又是怎样的呢?这将是本部分实验将阐述的问题。方法:将单核巨噬细胞分为THP-1组（对照组）、THP-1+PAO1组、THP-1+PAO1 BF组。RT-PCR检测THP-1细胞炎症因子IL-1β、IL-18的基因转录情况。RT-PCR检测THP-1细胞相关通路中关键蛋白NLRC4、NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因转录情况。ELISA法检测THP-1细胞炎症因子IL-1β、IL-18的表达。Western blot检测THP-1细胞相关通路中关键蛋白Caspase-1、Caspase-4、Caspase-1p20、Caspase-4 p20的表达情况。结果:与PAO1浮游细菌组相比,野生型P.aeruginosa PAO1 BF处理组的THP-1细胞IL-1βm RNA转录显著增加（P<0.05）,但IL-18 m RNA转录均没有明显改变。PAO1 BF促使THP-1细胞产生炎症因子IL-1β和IL-18（P<0.05）。与THP-1组相比,THP-1+PAO1 BF组的IL-1β、IL-18的基因转录明显增加（P<0.05）,且相关通路中关键蛋白NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因转录显著提高（P<0.05）,但NLRC4基因转录受抑制。PAO1 BF组与对照组相比caspase-1、caspase-4前体蛋白表达量均有所增加,且活化片段caspase-1 p20、caspase-4 p20的表达量也明显增加（P<0.05）。结论:野生型P.aeruginosa BF可以使单核巨噬细胞THP-1的Caspase-1活化,从而产生炎症因子IL-1β和IL-18。在野生型P.aeruginosa BF刺激下,单核巨噬细胞THP-1中NLRP3、Caspase-4表达增加,但是NLRC4表达受抑制,这说明PAO1 BF可能是通过Caspase-4刺激炎症小体NLRP3引起Caspase-1活化而激活细胞产生IL-1β和IL-18,而不是通过传统的NLRC4炎症小体引起的细胞产生IL-1β和IL-18。第三部分黏液型铜绿假单胞菌生物膜对单核巨噬细胞免疫逃逸及机制研究目的:第二部分已经证实了野生型P.aeruginosa BF使单核巨噬细胞THP-1产生细胞因子IL-1β和IL-18,且可能是通过Caspase-4激活NLRP3炎症小体从而引起Caspase-1活化。临床上,由于P.aeruginosa BF的持续慢性感染,野生型P.aeruginosa很容易突变为黏液型P.aeruginosa,且其BF的主要胞外基质为藻酸盐。那么,黏液型P.aeruginosa以及其主要胞外基质藻酸盐能否引起单核巨噬细胞产生炎症小体,从而引起IL-1β和IL-18的分泌增加呢?方法:将单核巨噬细胞分为THP-1组（对照组）、THP-1+FRD1BF组、THP-1+藻酸盐组。RT-PCR检测THP-1细胞炎症因子IL-1β、IL-18的基因转录情况。RT-PCR检测THP-1细胞相关通路中关键蛋白NLRC4、NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因转录情况。ELISA法检测THP-1细胞产生炎症因子IL-1β、IL-18的表达。Western blot法检测THP-1细胞相关通路中关键蛋白Caspase-1、Caspase-4、Caspase-1 p20、Caspase-4 p20的表达情况。结果:黏液型P.aeruginosa BF及藻酸盐均能使单核巨噬细胞THP-1发生皱缩,促使THP-1细胞产生炎症因子IL-1β和IL-18（P<0.05）,且与野生型P.aeruginosa BF相比,黏液型P.aeruginosa BF使单核巨噬细胞THP-1产生IL-1β和IL-18更多（P<0.05）。与THP-1组相比,THP-1+FRD1 BF组的IL-1β、IL-18的基因转录明显增加（P<0.05）,且相关通路中关键蛋白NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因转录显著提高（P<0.05）,进一步用western blot检测发现与THP-1组相比,THP-1+FRD1 BF组Caspase-1、Caspase-4前体蛋白表达增加,且其活化片段Caspase-1 p20、Caspase-4p20也表达明显增加。THP-1+藻酸盐组也能观察到类似的趋势。结论:黏液型P.aeruginosa FRD1 BF能使单核巨噬细胞THP-1的Caspase-1活化,从而产生炎症因子IL-1β和IL-18。在黏液型P.aeruginosa BF刺激下,单核巨噬细胞THP-1中NLRP3、Caspase-4表达增加,这说明FRD1 BF可能也是通过Caspase-4激活NLRP3炎症小体,从而引起Caspase-1活化。BF主要胞外基质藻酸盐也能引起单核巨噬细胞THP-1产生类似的反应。