枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属中的一种,为革兰氏阳性菌,细胞壁不含内毒素,能形成芽孢,被FDA认为是安全菌株(GRAS),是目前广泛应用于重组蛋白生产的宿主菌之一。枯草芽孢杆菌作为宿主菌的优势体现在拥有一套高效的蛋白分泌系统,这有利于胞外蛋白的分泌,十分适合蛋白的工业化生产。不足之处在于枯草芽孢杆菌产生大量蛋白酶,对外源蛋白造成严重的降解。利用基因工程的方法优化改造枯草芽孢杆菌表达系统以获得优良的酶工程菌是目前颇为重要的方向。由于外源蛋白在该系统的分泌一般需要枯草芽孢杆菌自身信号肽的引导,而目的蛋白与信号肽之间存在适配性问题,因此针对特定的目的蛋白需要一套信号肽筛选系统以获得最适信号肽,另一方面,枯草芽孢杆菌在对数生长末期会产生大量的蛋白酶,包括胞外蛋白酶以及胞内蛋白酶,关于降低胞外酶活的研究,已取得长足的发展,而对于胞内酶的研究鲜少涉及。本研究的第一部分首先选取实验室前期获得的两个酶基因:溶解性多糖单加氧酶CBP21和N-酰基高丝氨酸内酯降解酶AiiO-AIO6作为目的蛋白,以pWB980为基本骨架,通过无缝克隆等新型分子克隆手段,将信号肽添加至目的蛋白上游,从而构建了一系列信号肽筛选载体,并在枯草芽孢杆菌168中实现分泌表达。重组菌在SR培养基中培养24h后,分析上清液中目的蛋白在重组菌中的表达情况。结果显示:YlqB对溶解性多糖单加氧酶CBP21的引导分泌能力最强。而N-酰基高丝氨酸内酯降解酶AiiO-AIO6不需要枯草芽孢杆菌自身信号肽的引导,能自行分泌至胞外。本研究的第二部分,以两种丝氨酸水解酶基因YlbL和AprX,半胱氨酸水解酶基因YwpE,金属酶基因AmpS作为被敲除的靶基因,采用插入失活敲除靶基因的方法,构建了胞内蛋白酶敲除株△YlbL、△AprX、△YwpE、△AmpS,并将前期构建的表达溶解性多糖单加氧酶CBP21和N-酰基高丝氨酸内酯降解酶AiiO-AIO6的重组质粒转入敲除株,在SR培养基中培养24h后,初步分析发现:与野生型菌株相比△AprX、△YwpE、△AmpS均能使溶解性多糖单加氧酶CBP21和N-酰基高丝氨酸内酯降解酶AiiO-AIO6产量提高,而在敲除株△YlbL中,检测不到溶解性多糖单加氧酶CBP21的表达,N-酰基高丝氨酸内酯降解酶AiiO-AIO6产量较野生型的也有显著提高。通过对枯草芽孢杆菌表达外源蛋白的研究发现:以溶解性多糖单加氧酶和N-酰基高丝氨酸内酯降解酶为例,不同目的蛋白在枯草芽孢杆菌的分泌表达机制差异极大,其中溶解性多糖单加氧酶CBP21可以通过信号肽筛选提高其分泌量,对宿主菌进行胞内蛋白酶的敲除则可以同时提高溶解性多糖单加氧酶CBP21和N-酰基高丝氨酸内酯降解酶AiiO-AIO6的产量。