论文部分内容阅读
聚γ-谷氨酸(poly—γ-glutamic acid,γ-PGA)是由L-和(或)D-谷氨酸单体通过)γ-谷氨酰键连接形成的一种非核糖体多肽,具有生物可降解性和良好的吸水性,作为环境友好型生物高聚物具有广泛的应用前景。由于γ-PGA结构的多样性、合成的多样性、代谢调控的复杂性以及γ-PGA合成酶的不稳定性,到目前为止,对其生物合成机制还没有形成共识。
地衣芽孢杆菌WBL-3(Bacillus licheniformis WBL-3)是一种谷氨酸依赖型γ-PGA产生菌。本文根据B.licheniformis14580设计引物,从B.licheniformis WBL-3中克隆得到γ-PGA合成酶复合体基因pgsBCA(登录号:GQ249184),与B.licheniformis14580pgsBCA基因的同一性为97％,与Bacillus subtilis IF03336 pgsBCA基因的同一性只有74％。将pgsBCA基因克隆至表达载体pTrc99A,构建表达质粒pTrc-pgs,将其转化Escherichia coliJM109得到基因工程菌E.col JMi-pgs。对E.coli JM—pgs进行发酵生产γ-PGA,E.coli JM-pgs能产生胞外γ-PGA,产量为8.624 g／L。推测B.licheniformis WBL-3与Bacillus subtilis IFO3336有相似的γ-PGA催化机制,即由聚γ-谷氨酸合成酶单个酶催化合成。
聚γ-谷氨酸(γ-PGA)及其衍生物是一种新型土壤修复和改良材料,能吸附土壤中的重金属和放射性核物质等污染物,也可作为保水材料应用于干旱环境以及化妆品领域。NaCl、Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸四因素对B.licheniformis WBL-3合成γ-PGA产量及分子量有重要影响。分别用L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸代替L-谷氨酸,B0licheniformis WBL-3未产生γ-PGA,说明B.licheniformis WBL-3为严格的谷氨酸依赖型产生菌。以NaCl(0～7％),Mn(Ⅱ)(0-400μM),L-谷氨酰胺(0～2.0 mM),α-酮戊二酸(0～20 mM)进行单因素试验,表明:γ-PGA产量均随四因素浓度的增大呈现先增大后减小的趋势,γ-PGA产量分别在NaCl,Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸浓度为6％(w／v),100μM,1.5 mM和10 mM时达到最大值35.79g／L,24.77 g／L,30.07 g／L和26.09 g／L；γ-PGA分子量随NaCl浓度的增大而增大,随α-酮戊二酸浓度的增大而减小,随Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺浓度的增大而呈现先增大后减小的趋势。正交试验证明了单因素试验的结论,四因素间没有交互作用的影响,最优组合为NaCl.6％,α-酮戊二酸:10 mM,Mn(Ⅱ):100μM,L-谷氨酰胺:1.5 mM,产量达到55.62 g／L。