血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）位于血管中膜,是构成血管壁的主要细胞成分。成熟的VSMC的主要功能是收缩以及调节血管的张力。在正常的血管中,VSMC的表型以分化型为主,当血管受到损伤后,VSMC从分化表型转化为合成型,获得增殖及迁移能力,并大量合成细胞外基质,造成血管内膜增生及管腔狭窄。相反,当VSMC衰老导致VSMC功能障碍时,往往引发高血压、动脉粥样硬化等心血管相关疾病。高血压发病率高,是心衰、心肌梗死等心血管疾病的重要危险因素。预计到2025年,高血压将会影响29.2%的世界人口,患病人数达到15.6亿。高血压的发病机制虽被广泛研究,但仍未完全阐明。高血压发生发展的病理生理学改变涉及血管内皮调节异常、VSMC功能障碍、氧化应激、慢性炎症反应、交感神经系统激活、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）调节活性改变等。另外,由于VSMC收缩及血管重构引起的血管直径缩小、血管阻力增加也是高血压发生的重要原因之一。深入研究和认识VSMC收缩功能的调节机制对高血压防治具有重要意义。细胞衰老是指细胞丧失生长分裂的能力,为不可逆的细胞生长阻滞。由于衰老细胞内细胞器的结构改变,衰老细胞表现为细胞体积变大,以及出现广泛空泡化现象。另外,衰老细胞还伴随有基因表达的改变,如调节细胞周期的p53、p21和p16蛋白表达上调;位于溶酶体中的衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）活性升高。同时,衰老细胞还表现为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）,分泌促炎细胞因子等蛋白质,对衰老细胞及细胞外环境产生影响。近年来,细胞衰老与衰老相关疾病的关系引起了广泛的关注。虽然在VSMC衰老与高血压、动脉粥样硬化、动脉瘤等心血管疾病的关系的研究方面取得很大进展,但VSMC衰老的分子机制尚有待阐明。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新发现的非编码RNA,对真核基因的表达具有重要的调控作用。与线性RNA（linear RNA,含5’和3’末端）不同,环状RNA为首尾共价连接的环状结构,没有游离的5’和3’末端,不能被核酸外切酶水解,可在细胞内稳定存在。环状RNA可通过多种方式调节基因的表达:与miRNA结合解除其对靶基因的抑制作用;与RNA结合蛋白结合或作为蛋白质结合的支架;细胞核转录因子的调节者等。近年来有研究报道,环状RNA与细胞衰老及高血压发生密切相关。例如,circ-Foxo3通过与衰老相关蛋白ID1和E2F1以及应激相关蛋白HIF1a和FAK结合,促进阿霉素诱发的心脏衰老。我们实验室前期在人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cell,HASMC）中发现来源于ACTA2基因（编码α-SMA）的环状RNA circACTA2,证明circACTA2通过吸附miR-548f-5p而上调α-SMA的表达,NRG-1/circACTA2/miR-548f-5p形成调节轴协同调节α-SMA表达及VSMC的收缩功能。然而,circACTA2调节HASMC细胞收缩的具体机制尚不清楚,circACTA2是否参与VSMC衰老相关的高血压的发生发展过程也有待于深入研究。本研究探索影响VSMC表达circACTA2的因素,研究circACTA2调节VSMC收缩及其在衰老相关的高血压发生发展中的作用及机制。第一部分FN1介导circACTA2对VSMC收缩的调节作用目的:探讨AngⅡ对circACTA2表达的影响以及circACTA2在AngⅡ诱导VSMC收缩中的作用。方法:1 AngⅡ和PDGF-BB刺激VSMC后,qRT-PCR检测circACTA2的表达。2 qRT-PCR和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测高血压病人血管组织中circACTA2的表达。3鬼笔环肽染色检查AngⅡ刺激和/或circACTA2过表达对细胞骨架及肌丝的影响。4 RAP（RNA antisense purification）和U-生物素标记的RNA pull-down技术结合液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）定量分析鉴定与circACTA2结合的蛋白质。5 RNA pull-down和RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）检测circACTA2与FN1的相互作用。6在VSMC中过表达circACTA2、AngⅡ处理和/或敲低FN1,Western blot检测FN1的表达,鬼笔环肽染色观察肌丝及细胞骨架的变化。7在VSMC中过表达circACTA2的同时敲低FN1,观察乙酰胆碱诱导的细胞收缩的变化。8免疫荧光染色检查高血压病人血管组织中circACTA2和FN1的共定位及相互作用。结果:1 AngⅡ诱导circACTA2的形成AngⅡ在高血压的发生发展中发挥重要作用。我们首先给予VSMC AngⅡ或PDGF-BB刺激,qRT-PCR检测circACTA2表达。结果显示,在AngⅡ作用下,circACTA2的表达显著增加;而PDGF-BB下调circACTA2表达,结果具有统计学意义。另外,我们也检测高血压患者血管中circACTA2的表达情况。结果显示,与正常血管组织相比,高血压患者血管中circACTA2的表达明显升高。利用circACTA2荧光探针进行荧光原位杂交（FISH）实验也显示,circACTA2在高血压病人血管组织中的表达明显高于正常对照组。我们进一步观察circACTA2过表达对细胞骨架组构的影响。用慢病毒p WPI-circACTA2表达载体感染VSMC 24 h后,再用AngⅡ处理细胞。鬼笔环肽染色结果显示,与对照组相比,AngⅡ刺激或circACTA2过表达均能使F-肌动蛋白成束增加,应力纤维明显增粗;二者的共同作用效果更加显著。2 circACTA2与FN1和ILF3相互作用为了进一步明确circACTA2在VSMC中的作用机制,我们用RAP（RNA antisense purification）或U-生物素标记的RNA pull-down技术结合液相色谱-质谱（LC-MS）定量分析鉴定与circACTA2结合的蛋白质。将反义寡核苷酸序列或U-生物素标记的circACTA2沉降的蛋白质与它们相应的对照组进行定量比较分析（log2>2,moderated T-test,p<0.05）,我们确认与circACTA2高度特异结合的蛋白质包括FN1、ILF3和VIM等,但不包括β-actin,说明其相互作用的特异性。RNA pull-down及RIP实验进一步验证了circACTA2与这3种蛋白质的结合。以上结果说明,circACTA2可以与FN1及ILF3相互作用。3 circACTA2通过上调FN1表达而促进VSMC收缩为了确定circACTA2是否影响FN1、ILF3和VIM表达,我们在VSMC中过表达circACTA2后进行Western blot分析,结果显示,FN1的表达明显增加,而ILF3和VIM的表达没有明显改变。加入不同浓度(0,10-7,2×10-7,4×10-7mol/L)的AngⅡ刺激后,FN1的表达水平随着AngⅡ浓度升高而增加。用靶向FN1的si RNA敲低FN1的表达能够消除AngⅡ对FN1表达的诱导作用。我们进一步检查circACTA2和FN1对细胞收缩的影响。鬼笔环肽染色结果显示,过表达circACTA2促进细胞肌丝的形成,并且成束增加;而在VSMC中过表达circACTA2的同时敲低FN1则使细胞肌丝减少。细胞收缩实验结果显示,过表达circACTA2促进乙酰胆碱诱导的细胞收缩,而同时敲低FN1后消弱了其对细胞收缩的促进作用。这些结果表明,FN1介导circACTA2对细胞收缩的调节作用。为了探索circACTA2促进细胞收缩是否与circACTA2和FN1的相互作用有关,我们利用circACTA2荧光探针和FN1抗体进行FISH实验。实验结果显示,与对照组相比,AngⅡ处理使circACTA2和FN1表达增加的同时,二者之间的结合也明显增加,二者共定位于细胞的胞浆中。取高血压病人的动脉组织进行荧光染色也得到了同样的结果。结果提示,AngⅡ促进circACTA2与FN1的相互作用。小结:综上所述,AngⅡ显著诱导circACTA2的形成,后者通过与FN1相互作用促进VSMC收缩。第二部分circACTA2调节VSMC收缩的作用机制目的:揭示circACTA2上调FN1表达以及调节FN1与SPTBN1相互作用的分子机制。方法:1 RNA pull-down联合高通量测序鉴定circACTA2吸附的miRNA。2用AngⅡ和PDGF-BB处理VSMC后,qRT-PCR检测这些miRNA的表达变化。3生物信息学软件预测FN1是miR-149的靶基因,在VSMC中过表达或敲低miR-149,Western blot检测FN1的表达。4双荧光素酶报告基因验证miR-149与FN1 3’UTR的结合。5在VSMC中过表达circACTA2的同时敲低miR-149,检查乙酰胆碱诱导的细胞收缩,鬼笔环肽染色观察细胞骨架和肌丝的变化。6 RNA-蛋白质相互作用预测网站预测FN1与circACTA2的结合部位。7细胞过表达GFP-FN1（183-275）,Western blot检测GFP-FN1（183-275）及FN1的表达。8细胞过表达GFP-FN1（183-275）的同时给予AngⅡ刺激,Western blot检测FN1的表达。9细胞过表达GFP-FN1（183-275）,RIP检测FN1（183-275）与circACTA2的结合。10细胞过表达circACTA2的同时过表达GFP-FN1（183-275）或加入封闭结合位点的寡核苷酸序列,RIP检测FN1与circACTA2的结合。11细胞过表达circACTA2的同时过表达GFP-FN1（183-275）,鬼笔环肽染色观察细胞骨架和肌丝的变化。12 CoIP-MS鉴定与FN1结合的蛋白质。13细胞过表达GFP-FN1（183-275）或给予AngⅡ刺激,免疫共沉淀（Co IP）检测FN1与SPTBN1的结合。14细胞过表达circACTA2的同时敲低FN1,免疫荧光检测FN1与SPTBN1的共定位及相互作用。结果:1 circACTA2通过吸附miR-149间接调节FN1表达利用RNA pull-down联合高通量测序方法鉴定circACTA2可以吸附的miRNA。首先向AngⅡ和PDGF-BB处理的细胞裂解液中分别加入生物素标记的circACTA2探针和对照探针进行RNA pull-down,然后提取总RNA进行miRNA测序。结果显示,有24种miRNA可以被circACTA2探针所富集。为了验证miRNA的测序结果,我们利用qRT-PCR检测RNA pull-down沉淀物中相关miRNA表达。与对照探针相比,miR-27b-3p、miR-27b-5p、miR-149、miR-197等在circACTA2探针所富集的miRNA中明显上调,结果具有统计学意义。荧光素酶报告基因证实,circACTA2能与miR-149相结合。另外,用AngⅡ或PDGF-BB刺激VSMC,qRT-PCR检测这些miRNA的表达。结果显示,miR-149和miR-487b-3p在AngⅡ刺激的细胞中明显下调,而在PDGF-BB的作用下明显上调,并且与circACTA2的变化相反,表明circACTA2可与这两种miRNA相互作用。我们进一步发现,在FN1的3’UTR具有miR-149的结合位点。为了验证miR-149对FN1表达的影响,我们设计miR-149的模拟物及抑制剂并用它们转染VSMC。Western blot结果显示,miR-149的模拟物抑制FN1蛋白在VSMC中的表达,反之,miR-149的抑制剂增加FN1蛋白的表达,说明FN1被miR-149负调控。双荧光素酶报告基因分析结果也提示,miR-149模拟物能抑制FN1 3’UTR指导的报告基因表达。这些结果说明,circACTA2通过吸附miR-149解除其对FN1表达的抑制。另外,在用慢病毒p WPI-circACTA2感染细胞的同时加入miR-149的抑制剂,抑制剂能够进一步促进乙酰胆碱诱导的细胞收缩。鬼笔环肽染色显示,circACTA2过表达的同时抑制miR-149表达,细胞肌丝形成进一步增多,肌丝成束更加明显。结果提示,抑制miR-149表达对细胞收缩具有促进作用。2干扰circACTA2与FN1相互作用可抑制circACTA2对VSMC收缩的诱导我们通过RNA-蛋白质相互作用预测网站预测circACTA2与FN1的结合位点,发现FN1的237-252aa肽段可能是circACTA2的结合部位。我们设计可以编码FN1的183-275aa肽段的DNA序列与GFP-C1空载体连接,用于表达FN1的183-275aa肽段,称为GFP-FN1（183-275）。Western blot结果显示,转染该载体后细胞可表达GFP-FN1（183-275）。接着,我们分别用GFP-C1和GFP-FN1（183-275）转染VSMC细胞,利用抗GFP抗体进行沉淀,RIP-PCR检测两种沉淀物中circACTA2的富集情况。结果显示,GFP-FN1（183-275）富集的circACTA2明显高于GFP-C1组,说明GFP-FN1（183-275）能够与circACTA2相结合。重要的是,在VSMC中过表达GFP-FN1（183-275）能够显著抑制FN1蛋白的表达,说明干扰FN1与circACTA2的结合可促进FN1的降解。另外,转染GFP-FN1（183-275）能够消除AngⅡ对FN1表达的诱导作用。我们进一步用RIP实验研究GFP-FN1（183-275）对circACTA2与FN1结合的影响。首先,在用慢病毒过表达circACTA2的同时再转染GFP-FN1（183-275）,细胞裂解后加入抗FN1抗体。结果显示,在过表达circACTA2的细胞中,circACTA2被FN1抗体的富集明显升高,但是,在同时转染GFP-FN1（183-275）的细胞中,被FN1抗体富集的circACTA2减少,说明GFP-FN1（183-275）能够干扰circACTA2与全长FN1的结合。此外,我们设计一段可以与FN1结合的寡核苷酸,封闭FN1分子上与circACTA2结合的位点后,再用抗FN1抗体检查其对circACTA2的富集作用。结果显示,这段具有封闭作用的寡核苷酸明显抑制了FN1抗体对circACTA2的富集。接着,我们观察GFP-FN1（183-275）对细胞骨架的影响。鬼笔环肽染色结果显示,转染GFP-FN1（183-275）使细胞肌丝明显减少,并且GFP-FN1（183-275）还可以抑制过表达circACTA2引起的肌丝增加。提示GFP-FN1（183-275）通过干扰circACTA2和FN1相互作用而抑制circACTA2对VSMC收缩的诱导。3 FN1通过与SPTBN1相互作用调节VSMC收缩我们进一步通过Co IP-MS实验来寻找可以与FN1相互作用的蛋白质。将VSMC分为对照组和AngⅡ处理组,收集细胞裂解后加入抗FN1抗体,然后对免疫沉淀物进行质谱分析。结果显示,在AngⅡ处理的细胞中有14种蛋白质与FN1发生特异性结合,包括SPTBN1、CALU等。其中SPTBN1引起了我们的兴趣。SPTBN1属于细胞骨架蛋白,通过与肌动蛋白结合形成细胞骨架。因此我们设想,FN1通过与SPTBN1相互作用调节细胞收缩。我们进一步用Co IP分析验证质谱分析结果,发现FN1确实与SPTBN1相互结合,并且AngⅡ促进二者的结合。免疫双荧光染色结果也显示,FN1与SPTBN1在胞浆共定位,circACTA2过表达增加FN1与SPTBN1的相互作用,敲低FN1则抑制它们的结合。另外,Co IP实验结果显示,当细胞转染GFP-FN1（183-275）后,FN1与SPTBN1的结合作用减弱。这些结果表明,circACTA2通过调节FN1与SPTBN1相互作用促进VSMC收缩。小结:综上所述,一方面,circACTA2通过吸附miR-149,解除其对FN1表达的抑制而上调FN1表达;另一方面,circACTA2通过与FN1结合而调节FN1与SPTBN1的相互作用,进而促进VSMC收缩。第三部分circACTA2通过与ILF3相互作用促进AngⅡ诱导的VSMC衰老目的:揭示circACTA2介导AngⅡ诱导VSMC衰老的分子机制。方法:1用AngⅡ刺激VSMC和/或在VSMC中过表达或敲低circACTA2,SA-β-gal染色检查细胞衰老、Western blot检测p21、p16和CDK4的表达。2在VSMC中过表达或敲低ILF3,SA-β-gal染色检查细胞衰老、Western blot检测ILF3、p21、p16和CDK4的表达,Brd U掺入实验检测细胞增殖。3在VSMC中过表达或敲低ILF3,qRT-PCR检测CDK4 m RNA的表达。4在VSMC中过表达或敲低ILF3,然后加入放线菌素D,作用不同时间后,qRT-PCR检测CDK4 m RNA表达。5 GST pull-down检测CDK4、cyclin D1、cyclin E1 m RNA与ILF3的结合。6 RNA pull-down检测CDK4、cyclin D1、cyclin E1 m RNA与ILF3的结合。7细胞经AngⅡ处理后,GST pull-down和RNA pull-down检测CDK4m RNA或circACTA2与ILF3结合的变化。8在VSMC中过表达circACTA2的同时过表达ILF3,然后加入放线菌素D,作用不同时间后,qRT-PCR检测CDK4 m RNA表达。9在VSMC中过表达circACTA2的同时过表达ILF3,SA-β-gal染色检查细胞衰老。结果:1 AngⅡ通过上调circACTA2表达促进VSMC衰老我们前部分研究证实,AngⅡ显著上调circACTA2在VSMC中的表达,许多研究也报道,AngⅡ能够诱导VSMC的衰老。为此,我们想进一步研究circACTA2是否参与AngⅡ诱导的VSMC衰老的发生与发展过程。HASMC被10-7mol/L AngⅡ刺激72h,用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒检查SA-β-gal活性。结果显示,与对照组相比,AngⅡ处理的细胞被染成蓝色的衰老细胞明显增多,结果具有统计学意义。接着,我们利用Western blot检测衰老标志基因p21和p16的表达。结果显示,AngⅡ处理后,VSMC中p21和p16蛋白表达明显增加。而且,细胞周期特异性蛋白CDK4表达明显下调,这些结果说明,AngⅡ促进VSMC的衰老。我们进一步检查circACTA2过表达对细胞衰老的影响。结果显示,在circACTA2过表达的细胞中SA-β-gal活性升高,衰老标志基因p21和p16的表达明显上调。反之,用sh RNA敲低circACTA2表达后,SA-β-gal活性降低,p21和p16表达明显下降。这些结果表明,circACTA2过表达促进细胞衰老。接着,我们在给予VSMC AngⅡ处理的同时,敲低circACTA2的表达。SA-β-gal染色和衰老标志基因表达检测结果显示,敲低circACTA2部分抵消了AngⅡ对细胞衰老的促进作用。这些结果说明,circACTA2介导AngⅡ对细胞衰老的诱导作用。2 circACTA2通过与ILF3相互作用促进AngⅡ诱导的细胞衰老我们进一步研究circACTA2介导AngⅡ诱导的细胞衰老是否与circACTA2结合蛋白有关。在前面的实验中,我们发现,circACTA2可以与ILF3结合,于是我们检测ILF3对细胞衰老的影响。用sh ILF3敲低ILF3表达后,SA-β-gal染色阳性细胞增多,衰老标志基因p21和p16表达明显增加,CDK4表达减少。我们还检测了ILF3对细胞增殖的影响。Brd U掺入实验结果显示,敲低ILF3抑制细胞增殖。反之,当过表达ILF3后,SA-β-gal染色阳性细胞减少,p21和p16表达下调,CDK4表达上调。结果说明,ILF3抑制VSMC衰老。接下来,我们在给予细胞AngⅡ刺激的同时过表达ILF3。结果显示,过表达ILF3部分抵消了AngⅡ对细胞衰老的诱导作用。这些结果说明,circACTA2通过与ILF3相互作用促进AngⅡ对细胞衰老的诱导作用。3 ILF3通过稳定CDK4 m RNA而上调CDK4表达,进而抑制细胞衰老我们进一步研究ILF3如何影响细胞衰老。在前面的实验中我们发现,ILF3上调CDK4的表达。因此我们推测,ILF3可能通过影响CDK4的表达抑制细胞衰老。qRT-PCR结果显示,ILF3过表达促进VSMC中CDK4 m RNA的表达,而敲低ILF3则作用相反。ILF3是一种RNA结合蛋白,可以结合不同种类的RNA。有文献报道,ILF3可以结合cyclin E1的3’UTR,发挥稳定m RNA的作用。因此我们推测,ILF3可能与CDK4 m RNA的3’UTR结合,对其m RNA起稳定作用。我们的结果显示,敲低ILF3增强放线菌素D对CDK4 m RNA水平的下调作用,相反,ILF3过表达部分抑制了放线菌素D对CDK4 m RNA水平的下调。提示ILF3通过稳定CDK4 m RNA而上调CDK4表达。我们进一步验证ILF3是否确实能够结合CDK4 m RNA。首先,Co IP实验证明,抗ILF3抗体能够沉降足够的内源性ILF3。然后,我们通过体外的RIP实验,检测被带有GST标签的ILF3（GST-ILF3）所富集的m RNA。qRT-PCR结果显示,cyclin E1和CDK4 m RNA被显著富集,而cyclin D1m RNA含量很少。我们再通过RNA pull-down实验,在细胞内加入cyclin D1、cyclin E1和CDK4 m RNA的3’UTR探针后,检测它们与ILF3的结合。结果显示,cyclin E1和CDK4 m RNA的3’UTR能与ILF3结合,而cyclin D1m RNA无明显结合,与RIP结果相一致。4被AngⅡ上调的circACTA2通过与CDK4 m RNA竞争性结合ILF3而促进细胞衰老由于circACTA2与CDK4 m RNA都可以与ILF3结合,我们推测它们之间的结合可能存在竞争关系。为了证实这一推测,我们用AngⅡ处理细胞后进行RIP实验。利用GST-ILF3检测其与cyclin D1和CDK4 m RNA及circACTA2的结合。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,AngⅡ刺激明显增加GST-ILF3对circACTA2的富集,而对CDK4 m RNA的富集减少,对cyclin D1 m RNA的富集无明显影响。进一步,我们在给予细胞AngⅡ刺激后,进行RNA pull-down实验,检测AngⅡ对CDK4 m RNA和circACTA2沉降ILF3蛋白的影响。结果显示,AngⅡ作用后,circACTA2与ILF3的结合明显增加,而CDK4 m RNA与ILF3的结合显著减少。这些结果提示,circACTA2和CDK4 m RNA与ILF3之间的结合存在竞争性关系,即AngⅡ促进circACTA2与ILF3结合的同时,抑制CDK4 m RNA与ILF3的结合。我们进一步研究circACTA2与ILF3结合对CDK4 m RNA稳定性的影响。细胞分别过表达ILF3或circACTA2,或者同时过表达ILF3和circACTA2后,加入放线菌素D抑制转录过程。我们发现,与对照组相比,过表达circACTA2显著抑制放线菌素D对CDK4 m RNA水平的下调,而过表达ILF3作用相反;同时过表达ILF3和circACTA2时,circACTA2部分抵消了ILF3对CDK4 m RNA的稳定作用。这些结果提示,circACTA2过表达通过减少ILF3与CDK4 m RNA的结合而降低CDK4 m RNA的稳定性。我们最后检查circACTA2和ILF3对VSMC衰老的影响。SA-β-gal染色结果显示,circACTA2过表达使SA-β-gal染色阳性的衰老细胞增多;单独过表达ILF3减少衰老细胞的数量;当circACTA2和ILF3同时过表达时,ILF3部分抵消circACTA2对细胞衰老的诱导作用。小结:综上所述,AngⅡ促进circACTA2与ILF3结合的同时,抑制CDK4m RNA与ILF3结合,进而使CDK4 m RNA稳定性降低;CDK4因表达下调而导致VSMC衰老。结论:1在VSMC,AngⅡ显著诱导circACTA2的形成,后者通过与FN1相互作用促进VSMC收缩。2一方面,circACTA2通过吸附miR-149,解除其对FN1表达的抑制而上调FN1表达;另一方面,circACTA2通过与FN1结合而调节FN1与SPTBN1的相互作用,进而促进VSMC收缩。3 AngⅡ促进circACTA2与ILF3结合的同时,抑制CDK4 m RNA与ILF3结合,进而使CDK4 m RNA稳定性降低;CDK4因表达下调而导致VSMC衰老。