论文部分内容阅读
肺炎链球菌通过空气传播,并且吸附在鼻咽部、支气管或肺内,然后定植并侵入体内,造成侵袭性肺炎链球菌疾病(IPD)如:脑膜炎、菌血症、败血症和腹膜炎等相关疾病,并且在婴儿、癌症患者、老年人、艾滋病患者等高危人群具有较高的发病率和致死率。近些年来,疫苗的应用成为预防肺炎球菌多种血清型和耐药性问题的关键方式。目前世界范围内普遍应用的肺炎疫苗分别为肺炎多糖-蛋白结合疫苗和肺炎荚膜多糖疫苗。但这二类疫苗都存在着一定的缺陷。肺炎荚膜多糖疫苗是非T细胞依赖的疫苗,不具有免疫记忆性,需要经常免疫,且对儿童和老年人的保护效果不太理想。肺炎多糖-蛋白结合疫苗虽然克服了上述缺点,但其生产工艺复杂,成本较高,价格比较昂贵,且保护范围也有限。现今疫苗研究方向主要集中于具有广谱性的蛋白疫苗,以此来提高疫苗对老人和儿童的保护率和克服制备工艺复杂、价格昂贵等缺点,同时也能克服现有疫苗对肺炎链球菌的多种血清型上的限制。本论文应用原核表达系统构建、表达并制备了Sp的PhtD和PcpA蛋白,评价它们作为疫苗候选的免疫原性和免疫保护性。本论文选用肺炎链球菌胆固醇结合蛋白A(Pneumococcal Choline-binding Protein A,PcpA)N端377个氨基酸的截断蛋白和肺炎链球菌肺炎球菌组氨酸三联蛋白(Pneumococcal Histidine Triad ProteinD,PhtD)及其 N 末端 210 个氨基酸的截断蛋白作为蛋白疫苗候选,分别命名为PcpAN377,PhtD和PhtDN210。将PcpAN377,PhtD 和 PhtDN210分别进行设计并合成 PhtD,PcpAN377 和 PhtD N21C0两个截断型基因序列,构建原核表达质粒pET20b-PcpAN377,pET20b-PhtD和pET20b-PhtDN210中,然后在BL21(大肠杆菌)中表达蛋白。将表达并纯化后的PcpAN377,PhtD和PhtDN210蛋白免疫动物,实验对象分别为Balb/c小鼠与家兔,获得多克隆抗体血清,检测血清多抗,结果表明PcpAN377,PhtD和PhtDN210具有较高免疫原性。对PcpAN377,PhtD和PhtDN210的小鼠攻毒保护性进行了初步评价。结果表明PcpAN377和PhtD蛋白具有免疫后攻毒小鼠的生存率可达50%以上,其中PcpAN377蛋白20μg组中小鼠的生存率可达90%,这表明PcpAN377蛋白可作为肺炎链球菌疫苗的候选免疫原之一。由于肺炎链球菌在侵染机体初期主要有三个步骤,分别是吸附、定植、侵入。吸附过程在肺炎链球菌的后续侵染中起到至关重要作用,这一步骤主要由其表面蛋白吸附至上皮细胞,这一过程也被称为粘附,调节肺炎链球菌附着于宿主细胞表面。此外本室已通过流式细胞仪技术测定PcpAN377蛋白为肺炎球菌表面蛋白,所以,本论文还运用抗PcpAN377蛋白抗体抑制肺炎链球菌的细胞粘附实验检测了 PcpAN377蛋白的免疫抗体对肺炎链球菌粘附的拮抗作用,从机理上证明了PcpAN377蛋白作为免疫原的可行性。