神经源性疼痛(Neuropathic Pain)是由于神经系统的原发损伤或功能障碍而引起的疼痛综合征,主要表现为痛觉过敏、异常痛敏和自发性疼痛等。神经源性疼痛的发病机制不清,是当今困扰人类较为严重的临床问题之一。目前对神经源性疼痛尚没有特效的治疗药物,常用阿片类和中枢神经抑制剂控制疼痛,但阿片类镇痛药对部分神经源性疼痛几乎无效,而作用于中枢神经系统的药物副作用较大,限制了药物的剂量,使其不能达到有效的镇痛作用。因而,探寻神经源性疼痛的发病机制,寻求作用于脊髓或外周部位、不具有中枢神经系统副作用的药物,显得尤为迫切。Mrgs(Mas-related genes)相关受体是2001年发现的一类与疼痛密切相关的新型G蛋白偶联受体,其内源性配体主要有阿片肽和神经肽,由于阿片肽前体的水解片断能高效激活Mrgs受体,产生镇痛作用,所以被定义为外周阿片受体。Mrgs受体家族中大部分成员的mRNA都特异地、以非重叠形式表达于背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)的小直径感觉神经元上。这种特异性表达模式提示,该家族受体很可能成为研发无中枢副作用的镇痛药物的潜在靶点。本研究选用大鼠神经源性疼痛模型,探讨外周阿片受体与疼痛的关系。Mrgs受体在大鼠体内的亚型主要有MrgA、B、C、D等多种,其中MrgD亚型的表达量较多,尤其是在DRG非肽能、小直径IB4+神经元上表达,与ATP门控离子通道腺苷受体(P2X3)和辣椒素受体(VR1)相互重叠分布。已有研究表明,P2X3和VR1受体均参与了神经源性痛的外周机制,那么MrgD受体也有可能参与了神经源性痛的发病过程。因此,本研究以MrgD受体为靶标,观察其在动物和细胞水平的表达变化。研究目的:观察在痛敏形成和发展过程中MrgD受体在DRG、脊髓和脊髓上水平表达的动态变化,以及不同类型的药物干预对MrgD受体激动状态的影响。研究方法:建立大鼠神经源性疼痛模型,用Von frey filament测定机械痛觉超敏和痛觉过敏,用热辐射刺激引起缩足的潜伏期代表对热刺激的敏感程度,并以此来确定痛敏的形成;采用实时定量PCR和Western blot分析方法测定MrgD受体的表达量;MrgD定向克隆于含有不同标签的真核表达载体,瞬时转染细胞,用细胞定位、免疫共沉淀等方法验证MrgD二聚体的形成。研究结果:1.建立了坐骨神经慢性压迫损伤(CCI)模型、脊神经结扎模型(SNL)和中枢神经损伤强啡肽(DYN)模型。通过对三种神经源性疼痛动物模型综合分析和比较,我们采用慢性压迫坐骨神经损伤(CCI)模型来研究MrgD受体和神经源性疼痛的关系。2.在CCI模型上进行药物治疗,结果显示,MrgD受体非选择性激动剂BAM22P、阿片受体激动剂吗啡和抗癫痫药加巴喷丁均具有镇痛作用,其中吗啡作用最强;同时给予BAM22P和阿片受体拮抗剂Naloxone,BAM22P仍显示一定的镇痛作用,其镇痛作用可能是通过MrgD受体起作用的。3.分析MrgD受体的表达与神经源性疼痛发生和发展的关系。在正常动物DRG和脊髓上,我们发现MrgD受体以单体和二聚体两种形式存在;在MrgD受体表达与神经源性疼痛(CCI模型)的关系方面,结果显示MrgD受体mRNA和蛋白在神经源性疼痛的形成过程中均表达增加,其中造模3d时,DRG MrgD受体mRNA和蛋白表达量达到最高;造模7d时,脊髓MrgD受体mRNA和蛋白表达量达到最高。以上结果说明MrgD受体的表达与神经源性疼痛具有一定的相关性。当用上述药物干预后,只有在BAM22P刺激作用下,MrgD受体单体和二聚体水平发生了相互转化,单体表达量升高,二聚体表达量下降。4.构建瞬时表达重组rMrgD受体的HEK293细胞株。利用聚合酶链反应(PCR)技术,从总RNA中扩增出目的基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1myc-hisB和pcMV-HA中,构建真核表达rMrgD载体,瞬时转染HEK293细胞得到重组质粒表达细胞株。通过免疫荧光和western blot方法对表达产物进行鉴定。直接和间接免疫荧光实验皆表明rMrgD主要定位于细胞膜上,western blot实验证实rMrgD在HEK293细胞主要以单体和二聚体形式存在;瞬时共转带有HA和myc标签的rMrgD受体,通过免疫共沉淀进一步证实rMrgD自身能够形成二聚体,这为进一步研究rMrgD受体的功能奠定了基础。5.在已建立的三种模型上对新型镇痛药Seselin及衍生物进行筛选。结果显示,Seselin在CCI模型上的镇痛作用最强(48%),比对照药阿司匹林(10%)强,但比Gab(76%)弱;在SNL模型上Seselin的镇痛作用较弱;在强啡肽模型上没有明显镇痛作用。在SNL模型上对Seselin衍生物进行药效学初步评价,其中三个化合物显示出了比Seselin较强的镇痛活性,镇痛活性还需进一步评价。结论:本研究从mRNA和蛋白水平首次证明MrgD受体在神经源性疼痛的形成过程中发挥了重要作用,Mrgs受体非选择性激动剂BAM22P具有一定的镇痛作用,作用于MrgD受体后可以促进受体单体和二聚体水平发生相互转化,单体表达量升高,二聚体表达量下降。预示着MrgD受体发挥药理作用可能是通过单体形式实现的。