胰岛素对人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的研究

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[目的]  探讨正常及高浓度葡萄糖(high glucose)条件下,.胰岛素(insulin)对人视网膜色素上皮细胞(cultured human retinal pigment epithelial cells-19,ARPE-19)细胞生长、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成、线粒体DNA氧化损伤标记物8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)及DNA氧化损伤修复标记物8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanine DNA glycosylase1,hOGG1)表达的影响。  [方法]  体外培养人视网膜色素上皮细胞(cultured human retinal pigment epithelialcells-19,ARPE-19),分别置于5.6mmol/L葡萄糖(正常葡萄糖组)及30mmol/L葡萄糖(高糖组)条件下培养,以不同浓度胰岛素(0U/L、100U/L、101U/L、102 U/L、103 U/L、104U/L)分别予以干预,各组培养12小时、24小时、48小时,以噻唑蓝(MTT)比色法检测视网膜色数上皮细胞增生活力;ARPE-19细胞置于5.6mmol/L葡萄糖及30mmol/L葡萄糖条件下培养,以103U/L,104U/L胰岛素分别予以干预,干预12小时、24小时、48小时,以2,7-二氯荧光素二乙酸酯(2,7-dichlorofluore scin-diacetate,DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)的产生情况,以免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)方法检测细胞内8-OHdG的表达量,以蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测胞浆中hOGG1的表达量。  [结果]  1、MTT法显示:不同浓度(0U/L、100U/L、101U/L、102 U/L、103 U/L、104U/L)胰岛素干预体外培养的人视网膜色素上皮细胞,正常浓度葡萄糖组及高浓度葡萄糖组的RPE细胞的增殖活力差别无统计学意义(P>0.05)。  2、DCFH-DA法:在正常浓度葡萄糖组,在各观察时间点,胰岛素浓度103U/L、104U/L干预组的ROS表达量与空白对照组相比,ROS表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05);在12小时胰岛素浓度104U/L干预组的ROS表达量与胰岛素浓度103U/L干预组相比增高,差异有统计学意义(P<0.05);细胞内ROS的表达量随103U/L、104U/L胰岛素作用时间的延长呈增加的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。  在高浓度葡萄糖组,12、48小时,细胞内ROS表达量随胰岛素浓度的升高呈增加的趋势;胰岛素干预组均显示细胞内ROS的表达量较空白对照组增高,差异具有统计学意义(P<0.05);胰岛素浓度104U/L干预组的ROS表达量与胰岛素浓度103U/L干预组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。24小时,胰岛素浓度103U/L的干预组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),胰岛素浓度104U/L干预组的ROS表达量与空白对照组、103U/L干预组相比,ROS表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05)。当胰岛素浓度为0U/L、103U/L时,细胞内ROS的表达量随作用时间的延长呈增加的趋势,24h组与12h组相比无统计学差异(P>0.05),48h组与12h、24h组具有统计学差异(P<0.05);当胰岛素浓度为104U/L时,细胞内ROS的表达量随作用时间的延长呈增加的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。  3、免疫细胞化学法:在正常浓度葡萄糖组,在各观察时间点,细胞内8-OHdG表达量随胰岛素浓度的升高呈增加的趋势,胰岛素浓度103U/L、104U/L干预组的8-OHdG表达量与空白对照组相比,8-OHdG表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05);12小时,胰岛素浓度104U/L干预组的8-OHdG表达量与103U/L干预组相比增高,差异有统计学意义(P<0.05)。当胰岛素浓度为104U/L时,细胞内8-OHdG的表达量随作用时间的延长呈增加的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。  在高浓度葡萄糖组,在各观察时间点,RPE细胞8-OHdG表达量随胰岛素浓度的升高呈增加的趋势,胰岛素浓度103U/L、104U/L的干预组与空白对照组相比,8-OHdG表达量增高,差异有统计学意义(P<0.05);胰岛素浓度104U/L干预组的8-OHdG表达量与胰岛素浓度103U/L干预组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。当胰岛素浓度为103U/L、104U/L时,细胞内8-OHdG的表达量随作用时间的延长呈增加的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。  4、蛋白免疫印迹法:在正常浓度及高浓度葡萄糖组,在各观察时间点,细胞内hOGG1表达量随胰岛素浓度的升高呈增加的趋势,胰岛素浓度103U/L、104U/L的干预组均显示细胞内hOGG1的表达量较空白对照组增高,差异具有统计学意义(P<0.05);胰岛素浓度104U/L干预组的hOGG1表达量与胰岛素浓度103U/L干预组相比,增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。当胰岛素浓度分别为103U/L、104U/L时,细胞内hOGG1的表达量随作用时间的延长而有增加的趋势,.差异具有统计学意义(P<0.05)。  [结论]  1.无论在正常状态还是高糖状态下,胰岛素对RPE细胞的增殖无明显影响。  2.无论在正常状态还是高糖状态下,高浓度胰岛素(104U/L)以时间依赖方式促进RPE细胞ROS生成、加重RPE细胞的氧化损伤。  3.无论在正常状态还是高糖状态下,高浓度胰岛素(104U/L)能够通过增加DNA糖基化酶hOGG1的表达以对DNA氧化损伤进行修复。
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