核酸修饰存在于各种生命形式中,并在基因表达的调控中起着至关重要的作用。到目前为止,在RNA中发现了100多种不同的转录后修饰,在这些RNA修饰当中,N~6-甲基腺苷(m~6A)是真核mRNA中最常见的碱基修饰,有超过80%的RNA碱基发生甲基化,且平均每2000个核糖核苷酸就有1个m~6A。m~6A高度参与转录后调控,例如mRNA剪接、翻译、核输出、mRNA衰减、亚细胞定位和组织特异性调控等,m~6A修饰的失调与人类多种疾病密切相关。最近的研究表明,脂肪量和与肥胖相关的FTO酶对细胞水平m~6A修饰的动态调节有重要的影响,FTO可以催化mRNA中N~6-甲基腺苷残基的去甲基化并调节细胞水平的m~6A修饰,在人类肥胖和癌症治疗中起关键作用。鉴于FTO在肥胖症和其他疾病中作为m~6A脱甲基酶的重要作用,高灵敏的检测FTO活性并开发其小分子抑制剂在生物学研究、临床诊断和药物发展领域中具有重要意义。量子点(quantum dots,QDs)是一类新型的半导体纳米材料,与传统的有机染料分子相比,量子点具有多种优势,特殊的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、生物大分子相互作用中有极大的应用前景。我们发展了一种基于单个量子点的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)纳米传感器,可用于超灵敏检测去甲基化酶FTO的活性及筛选其潜在的小分子抑制剂。该检测方法包括三个连续的步骤:(1)FTO介导的单链DNA(ssDNA)底物中m~6A的去甲基化,(2)Dpn II核酸内切酶辅助切割双链去甲基化的DNA底物,生成生物素化标记的捕获探针,(3)构建QD-DNA-Cy5纳米结构及荧光共振能量转移信号检测。首先,FTO介导的m~6A去甲基化可以诱导Dpn II对去甲基化DNA的特异性切割,产生生物素化标记的DNA片段,其次,该DNA片段作为捕获探针将Cy5标记的报告探针组装到量子点的表面,来引发量子点和Cy5之间的荧光共振能量转移,由此产生的Cy5信号可以通过全内反射荧光(total internal reflection fluorescence,TIRF)成像系统进行单分子检测。通过简单的计数Cy5分子,FTO的活性便可以得到精确的定量。此检测方法不需要任何的外部扩增,也不需要任何分离和清洗步骤,简便快速,检测限低至7.9?10~-1414 M。另外,我们筛选了FTO相关的抑制剂。抑制剂的存在可以抑制FTO去甲基化,从而抑制了量子点和Cy5之间的荧光共振能量转移。抑制剂对FTO去甲基化的抑制作用可以通过检测Cy5数量的减少来进行评估。我们利用这种纳米传感器筛选了几种小分子抑制剂,并最终确定双醋瑞因(Diacerein)是一种高选择性的FTO抑制剂。Diacerein可以抑制HeLa细胞内源性FTO的去甲基化活性。Diacerein既不是2-氧戊二酸(2-OG)的结构类似物,也不是金属离子的螯合剂,它是通过竞争性地与含m~6A的底物结合而选择性地抑制FTO的去甲基化活性。