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热激蛋白(HSPs)是一类逆境胁迫应激相关的主要功能蛋白,在生物胁迫适应和正常生命活动中起重要作用。根据其分子量可分为HSP110,HSP90,HSP70,HSP60和小分子热激蛋白,HSP70是目前为止研究最广泛、深入的热激蛋白家族,在生物温度和农药胁迫保护中具有重要作用。稻飞虱是我国主要水稻害虫之一,面临农药、气候变暖等环境胁迫。为了明确稻飞虱对温度和杀虫剂胁迫的适应机制,本文以灰飞虱和褐飞虱为研究对象,探索了其热激蛋白70家族的组成、诱导表达特性及功能,并深入解析了热激蛋白70在温度和毒死蜱胁迫交互适应中的作用。主要研究结果如下:一、HSP70序列的克隆与分析利用转录组和NCBI数据库获取灰飞虱和褐飞虱热激蛋白70同源基因序列,在灰飞虱中筛选出具有完整开放阅读框的hsp70序列共有12个,其中9个在正常或胁迫条件下表达。在褐飞虱中筛选出15个hsp70,其中8个在正常或温度胁迫下表达。ExPASy在线工具预测其所有HSP70基因均含该家族的3个标签序列,等电点为5.05-6.15,分子量为 66801.97-75283.42。MEGA 分析结果表明 KX695161、KX695162和KX976472与果蝇和人类的内质网热激蛋白70序列聚为一枝,而KX976477、KX976478和KX695164与线粒体热激蛋白70聚为一枝,说明这些hsp70可能分布在细胞质/细胞核、内质网、线粒体等器官。二、温度对HSP70的诱导采用实时荧光定量PCR技术分别检测了0,6,10,14,18,22,30,33,36,39,42,44℃胁迫后灰飞虱和褐飞虱hsp70的表达量变化。结果表明,灰飞虱热激蛋白70基因的表达量存在差异。在30-44℃高温胁迫后,KX695168表达量显著上升,其中在42℃和44℃胁迫下,表达量与对照相比上升了近千倍;其次是KX695160表达量增加,在30℃、33℃和36℃胁迫后,其表达量分别上升了 4.4倍,5倍和4.5倍;其余基因表达量变化不明显。在低温胁迫后Hsp70基因表达量与高温存在明显差异,KX695160表达量上升幅度最大,在14℃胁迫后,其表达量提高3.27倍,而KX695164表达量下降。褐飞虱热激蛋白70基因的表达量也与胁迫温度有关,在30-44℃高温胁迫后,KX976473和KX976476表达显著上升,KX976476在42℃胁迫后,表达量提高了 25倍,而KK976473在42-44℃胁迫后,其表达量提高了 200倍以上。在低温胁迫后,除KX976475在14℃胁迫后上升2.38倍,其余基因的表达量变化不显著或表达被下降。以上结果说明热激蛋白70在灰飞虱和褐飞虱高温应激中可能起重要作用,但在低温应激中的作用可能有限。三、毒死蜱对HSP70的诱导表达特性研究利用实时荧光定量PCR技术分别检测了 LC25和LC50剂量毒死蜱处理灰飞虱和褐飞虱0.5h、8h和24h后hsp70相对表达量。结果表明,灰飞虱和褐飞虱热激蛋白70基因表达量受毒死蜱浓度和处理时间的影响。在灰飞虱中,LC25剂量处理0.5h、8h后,KX695160和KP994341表达受到抑制,而KK695168表达量无显著变化;24h后,KX695168表达显著上升,其表达量提高了 6倍,而KX695160和KP994341表达仍受到抑制。LC50剂量处理0.5h、8h、24h后,KP994341和KX695160表达量均被抑制,而KX695168在0.5h和8h后表达量显著上升,在24h处理后表达被抑制。在褐飞虱中,LC25剂量处理0.5h、8h和24 h后,KX976471、KX976473和KX976475的表达量均上升,其中KX976473的表达量在处理8h后上升了 9.6倍。LC50剂量处理0.5h、8h、24h后,KX976473表达量显著上升,而KX976471和KX976475的表达量变化不显著。这些结果说明褐飞虱KX976473和灰飞虱KX695168在毒死蜱胁迫应激中可能具有一定的作用。四、HSC70功能研究HSC70是组成型HSP70,在正常条件下表达,受温度等胁迫因子轻微诱导,在生物温度适应性中具有重要作用。为明确HSC70在灰飞虱温度适应中的作用,我们采用RNAi研究了KP994340的功能。KP994340开放阅读框碱基数为1971bp,编码656个氨基酸。qPCR分析KP994340除在雌成虫中的表达量高于若虫与雄虫外,在不同龄期中的表达无显著差异。RNAi抑制KP994340基因的表达后,灰飞虱雌成虫耐热性下降,产卵量变化不显著,以上结果说明KP994340可能与灰飞虱温度组成抗性有关,与繁殖关系不大。五、HSP70在毒死蜱抗性品系高温适应性中的作用采用生命表构建技术,研究了毒死蜱抗性对灰飞虱适合度的影响。结果表明抗性灰飞虱相对适合度在24℃低于敏感品系,在30℃时高于敏感品系。转录组基因差异表达分析结果显示在抗性品系中有5个热休克蛋白基因表达量改变,其中上调的基因是KX695160和KX695161。根据序列特征KX695160可能位于细胞质/细胞核,而KX695161可能位于内质网。在30-44℃处理后,KX695160和KX695161的表达在抗性品系中有上调趋势。因为HSP70对高温胁迫具有明显的保护作用,因此毒死蜱抗性品系中这些基因的基础表达上调可能减少了高温对该品系的伤害,增加其相对适合度,但是在适合的温度条件下,反而降低其适合度。