研究背景:肾癌是全球发病率前十位的恶性肿瘤。据统计,每年大约新增290000名肾癌患者,其死亡率约占全球肿瘤致死率的2%。目前肾癌主要的治疗方式以手术为主;对于已经发生远处转移、瘤体自身过大、肿瘤生长部位局部解剖复杂的患者,临床上辅以靶向药物进行治疗。临床上常用的靶向药物包括索拉非尼、舒尼替尼等。靶向药物的问世使得肾癌患者生存获益明显,死亡率显著下降;但患者仍需要面对一个不可避免的问题,即靶向药物的耐药问题。因此如何解决患者的耐药问题或增强靶向药物对其的敏感性,成为了学者们需要攻克的难题。另一方面,更多的观点热衷于在日常饮食中摄入具有抗癌作用的食物,以此来防治肿瘤的发生,诸如姜黄素、芹黄素、大蒜素等都展示了一定的抗肿瘤效应。而甲氧基黄酮,这种主要存在于蔬菜、柑橘类的一种化合物,也被证明有抗炎、抗血管发生、促进细胞凋亡的功能。川皮苷是来源于柑橘类的一种甲氧基黄酮类化合物。现有研究表明,川皮苷抗肿瘤机制包括:抑制血管增殖通路Src/FAK/STAT3;抑制ERK、AKT等细胞增殖通路;抑制MMP2、MMP9等蛋白表达,进而抑制肿瘤细胞的转移。目前其抗肿瘤效应在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等都有介绍,但是在肾癌中却鲜有报道,因此探索川皮苷对肾癌的抗肿瘤效应以及是否能增强靶向药物索拉非尼的敏感性,具有很大的临床意义。目的:(1)探索川皮苷在体外对肾细胞癌抗肿瘤效应的生物学作用,并应用荷瘤裸鼠探索川皮苷体内的抗肿瘤效应;同时阐述其抗肿瘤的机制。(2)将川皮苷与索拉非尼联合应用,探索其是否增强索拉非尼敏感性,并分别通过体外的细胞学实验与体内的荷瘤裸鼠动物实验来验证二者的协同作用。方法:(1)通过CCK8实验、平板克隆形成实验,从而检测药物对肾癌细胞增殖能力的抑制作用;通过流式细胞术检测细胞周期与凋亡。(2)通过划痕实验、Transwell实验,分别检测肾癌细胞的迁移与侵袭能力。(3)应用蛋白免疫印迹,检测药物作用下相关蛋白的表达情况;应用AKT蛋白的激动剂IGF-1,探索其是否能抑制川皮苷作所产生的抗肿瘤效应,并尝试解释其分子水平的机制与通路。通过细胞间接免疫荧光染色,在共聚焦激光显微镜下观测相关蛋白在细胞内的变化。应用免疫组织化学染色分析肾癌组织芯片。(4)通过将肾癌细胞系接种于裸鼠背侧皮下,以灌胃方式给药,动态监测肿瘤体积,并在取瘤后称量瘤重。随后将肿瘤组织进行石蜡包埋、切片。通过TUNEL染色检测肿瘤凋亡,通过组织切片间接免疫荧光染色,检测相关蛋白表达。C57小鼠以灌胃方式给予川皮苷,动态监测体重;随后取材主要脏器,并进行石蜡包埋、切片。结果:(1)通过CCK8检测,结果显示川皮苷能显著抑制肾癌细胞的增殖能力,并且呈浓度依赖性与时间依赖性。平板克隆结果显示,川皮苷处理后的肿瘤细胞,其克隆集落明显小于空白对照组。细胞周期显示,川皮苷能阻滞肾癌细胞的分裂周期于G0/G1期。通过流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示川皮苷能促进细胞凋亡的发生。(2)划痕实验结果显示,川皮苷处理后的肾癌细胞,其向划痕中心的的迁移距离短于空白对照组;Transwell实验结果显示,川皮苷能显著抑制肿瘤细胞的侵袭能力。(3)蛋白免疫印迹结果显示,川皮苷能降低Src、AKT、STAT3、YAP的活化表达;应用间接免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观测发现,在川皮苷作用下,STAT3在肾癌细胞核内的定位显著减少,YAP在细胞内的总体表达显著降低。同时,将AKT的激动剂IGF-1作用于川皮苷处理后的细胞中,发现原先被川皮苷所抑制的p-AKT、p-STAT3与YAP蛋白,都可以被IGF-1恢复表达。同时肿瘤细胞降低的增殖能力也得到了提升。通过免疫组织化学染色,分析肾癌组织芯片,应用Kaplan-Meier生存曲线分析YAP表达与肾癌预后。结果显示,高YAP表达患者其预后较差。(4)荷瘤裸鼠给予川皮苷灌胃处理,结果显示给药组的肿瘤体积与重量都小于对照组;TUNEL结果显示,给药组中肿瘤细胞凋亡增多;肿瘤组织切片通过间接免疫荧光检测发现,给药组中肿瘤细胞的Ki-67、p-STAT3表达都降低,p-YAP表达增高。C57小鼠给予川皮苷后,体重并未有明显减轻;其心、肝、肾、脾、小肠的组织切片HE染色发现,与对照组相比,其组织结构并没有明显的病理改变。(5)同时将川皮苷联合索拉非尼作用于肾癌细胞,发现联合治疗抑制肾癌细胞增殖的效果显著高于二者单独用药,即二者具有协同效应。同样,在抑制迁移、侵袭,促进凋亡方面,联合治疗的效果也都显著高于二者单独用药。(6)荷瘤裸鼠分别被给予生理盐水、川皮苷、索拉非尼、川皮苷联合索拉非尼灌胃处理,结果显示联合用药组的肿瘤体积与重量都小于空白对照组、川皮苷组、索拉非尼组;肿瘤组织切片通过间接免疫荧光检测发现,相较于其他三组,联合用药组的肿瘤凋亡更多,细胞增殖活力下降更明显。结论:通过本课题的研究,我们首次明确了川皮苷抗肾细胞癌的生物学效应,并阐述了其通过Src/AKT、STAT3、YAP途径进行对肾癌细胞增殖能力的调控。同时我们还将川皮苷联合索拉非尼共同作用于肾癌细胞,并发现了川皮苷能显著增强索拉非尼治疗的敏感性。因此,无论是川皮苷的抗肾癌效应还是其与索拉非尼的协同效应,都将为肾癌的治疗提供新的研究基础和思路。下一步,我们将对药物优化配比以及临床转化进行更细致的研究。