【摘 要】
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酸奶及其相关制品在全球范围内具有广阔的消费市场,但此类产品的质量在储存、运输及销售过程中会逐渐降低,这主要是与其体系内耐酸细菌保加利亚乳杆菌继续利用残存乳糖代谢产酸引起的后酸化有关。此外,酸奶后酸化还会缩短产品保质期、降低消费者可接受度以及损害产品体系内益生菌的生存能力等,酸奶后酸化的控制已成为制约中国乳品行业发展的一个瓶颈。基于物理、化学和生物方法的食品质量危害因子关键控制技术已成为目前国内外学
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酸奶及其相关制品在全球范围内具有广阔的消费市场,但此类产品的质量在储存、运输及销售过程中会逐渐降低,这主要是与其体系内耐酸细菌保加利亚乳杆菌继续利用残存乳糖代谢产酸引起的后酸化有关。此外,酸奶后酸化还会缩短产品保质期、降低消费者可接受度以及损害产品体系内益生菌的生存能力等,酸奶后酸化的控制已成为制约中国乳品行业发展的一个瓶颈。基于物理、化学和生物方法的食品质量危害因子关键控制技术已成为目前国内外学者的研究热点。因此,本文对分离自传统发酵食品中的乳酸乳球菌进行产抑保加利亚乳杆菌细菌素菌株筛选及相关特性研究,优化乳酸乳球菌Q13产细菌素发酵培养基以及条件;从乳酸乳球菌Q13发酵液中提取纯化出细菌素并对其进行质谱分析,探讨细菌素拮抗保加利亚乳杆菌作用模式以及在酸奶中的初步应用效果。主要研究内容及结果如下:(1)从16株分离自传统发酵食品中的乳酸乳球菌中筛选得到一株对保加利亚乳杆菌LMG-1具有较强抑菌作用的菌株Q13。L.lactis Q13的体外安全性评估试验结果显示,溶血、吲哚和明胶液化试验结果均表现为阴性,说明该菌株不存在相关毒力因子合成机制;仅对阿米卡星(氨基糖苷类)和林可霉素(林可胺类)两类抗生素耐药,对其余23种抗生素敏感或中度敏感;并且其基因组DNA不携带tetS、tetM、vanA、catA和rpoB等5种耐药基因。由菌株Q13无菌上清液理化特性结果表明,L.lactis Q13所产抑菌物质是一种仅对革兰氏阳性菌有效并且具有良好热稳定性和酸碱稳定性的肽类物质。通过聚合酶链式反应确定菌株Q13基因组DNA中不仅携带乳酸链球菌素基因NisA/Z,还具有完整乳链菌肽生物合成基因簇。(2)基于乳清蛋白粉、大豆蛋白胨、蔗糖、乳糖酶和碳酸钙等五个营养因子对L.lactis Q13发酵培养基进行优化,最终确定后续实验发酵培养基:称取79g乳清蛋白粉,21 g大豆蛋白胨,加入UP水或RO水1 L,灭菌后于4℃储存备用。由培养条件的单因素试验结果发现,温度对细菌素产量影响较为显著(P<0.05),能够使相对抑菌效价提高2.5倍左右。最终由响应面优化试验确定了最优培养条件:发酵温度(27.5℃),初始p H值(8.0),接种量(1.4%),在该条件下模型预测值(634.16 AU/mL)和真实值(618.51 AU/mL)基本吻合。(3)L.lactis Q13所产细菌素分离纯化试验结果显示,最适硫酸铵饱和度为60%;仅有分子量大于10 kDa的超滤组分具有抑菌效果;由葡聚糖凝胶柱层析获得两组具有抑菌活性洗脱峰。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳试验结果发现经过三步纯化的细菌素纯化效果较好,仅呈现出相对单一条带,所对应分子量范围约为17~20 kDa。并利用MALDI-TOF/TOF分析上述细菌素纯化物分子量和肽段信息,测得细菌素相对分子质量为19367.97 Da,并获得两段氨基酸序列信息分别为SIITDIYAR和VNQIGTLTETFEAIEMAK,在NCBI数据库中未匹配到相同细菌素序列,说明本研究分离的细菌素可能为一种新型乳酸链球菌素。(4)乳酸链球菌素Q13针对于保加利亚乳杆菌LMG-1抑菌机制研究结果表明,经过乳酸链球菌素处理后,会导致保加利亚乳杆菌FDA荧光强度、胞内Na+K+-ATP和AKP酶含量降低,并且随着细菌素添加量的增大,三者含量降低程度越为明显。由扫描电镜图观察可知,对照组菌体形态结构完整,而处理组菌体细胞表面凹陷皱缩、形状卷曲变长以及胞外堆积大量细胞碎片。同时还发现在Nisin Q13的诱导作用下,会使指示菌PepT、PepX、PepQ、PepF、PepC、Oppd和PrtB等7种关键蛋白酶基因相对基因表达量均呈现显著上调。此外,在酸奶中的初步应用试验结果显示Nisin Q13的加入会延缓酸奶样品酸度的增加、有效改善酸奶产品品质以及提高产品稳定性。
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