随着科技的发展和社会的进步，电离辐射被广泛用于医用设备、研究机构、核反应堆及其辅助设施。现在治疗恶性肿瘤，放射治疗是一种重要的治疗方法。但放射治疗杀伤肿瘤细胞的同时，也会对周围的正常组织造成一定的损伤。而核电在使用过程中如操作不当，则会产生严重的核污染，如美国三里岛核电站核泄漏、切尔诺贝利核事故、日本福岛核事故等等。同时，核武器在现代战争中的使用也让人们的生命受到了极大威胁，如科索沃战争中，美军大量使用贫铀弹，使急性放射病人大量出现，患白血病的人数急剧上升。辐射对人类健康的威胁已经越来越广泛，目前被公认为是继水、大气、噪音污染之后的第四大污染。而加强电离辐射防护、防治各型放射病己成为当今急待解决的重要课题。肠上皮细胞是体内增殖能力最快的组织之一，而胃肠道是辐射敏感器官之一，在辐射中很容易受到伤害。在胃肠道，小肠隐窝上皮细胞最容易受到辐射诱导细胞凋亡。肠型放射病病情发展迅速，病人常会发生恶心、腹泻等症状，后果严重。在肠型放射病发病时，骨髓造血系统仍未发生变化，辐射对患者主要损伤来自于肠道粘膜的坏死。心脏辐射后可造成慢性心脏泵血功能损伤和其他心脏疾病。最显著的辐射诱导心脏疾病类型为心肌损害，该疾病由照射6-10周后毛细血管内皮细胞的碱性磷酸酶活性缺失所致。同时，由于心肌细胞退化，血管周围以及间质可出现纤维化。目前，巯基化合物是最有效的辐射防护药物。WR-2721可以有效的防护辐射对心脏的损害。但是其在使用过程中，副作用也十分明显，病人会出现恶心、呕吐、头晕等反应。在应用WR-2721时，仍需时刻注意其副作用的影响。所以，寻找一种安全、高效的辐射防护剂成为当前迫切的需要。电离辐射损伤机体的作用主要由辐射产生的羟自由基引起。Ohsawa等人发现，在生理学上，氢气并不是人们常认为的惰性气体，而具有选择性抗氧化的作用。氢气可以并且只与活性强和毒性强的活性氧反应，比如·OH和ONOO-，而不与可以传递重要信号的活性氧反应，是一种很好的抗氧化物质。我教研室在2008年将富H₂溶液首次用于细胞及小鼠的辐射防护，并且证明了富H₂溶液对细胞及小鼠具有很好的辐射防护作用。本课题试图通过富H₂溶液预处理减轻辐射造成的多个系统损伤、抑制细胞凋亡等来解释富H₂溶液的辐射防护效应，从而为临床应用富H₂溶液进行电离辐射防护、防治各型放射病提供实验和理论依据。研究内容：1.富H₂培养液对人小肠上皮细胞的辐射防护作用：选取人正常小肠上皮细胞系HIEC作为研究对象，观察以下指标：①γ射线辐射后HIEC细胞的存活率；②γ射线辐射后HIEC细胞凋亡率的变化以及形态学改变；③γ射线辐射后HIEC细胞中DNA链断裂的情况。2.富H₂生理盐水对γ射线辐射后Balb/c小鼠小肠的作用：①γ射线辐射后小肠中内源性抗氧化剂的变化；②γ射线辐射后氧化损伤的变化；③γ射线辐射后小肠组织的病理改变；④γ射线辐射后小肠细胞的凋亡改变；⑤腹腔注射富H₂生理盐水后，小肠内氢浓度的改变。3.富H₂培养液对人正常脐静脉内皮细胞的辐射防护作用：选取人正常脐静脉内皮细胞系HUVEC作为研究对象，观察以下指标：①γ射线辐射后HUVEC细胞的存活率；②γ射线辐射后HUVEC的细胞凋亡率及形态学改变。4.富H₂生理盐水对γ射线辐射后Balb/c小鼠心脏的作用：①γ射线辐射后Balb/c小鼠的30天存活率；②γ射线辐射后心脏中内源性抗氧化剂的变化；③γ射线辐射后心脏的氧化损伤变化；④γ射线辐射后心脏组织的病理改变；⑤γ射线辐射后心肌纤维化的改变；⑥γ射线辐射后心肌细胞DNA链的断裂情况。5.富H₂溶液辐射防护作用的机制研究：①利用HPF探针，观察富H₂溶液清除HIEC细胞内辐射所致·OH的效果；②富H₂溶液对辐射后小鼠小肠caspase-3活性的影响；③富H₂溶液对照后细胞中凋亡相关蛋白表达的影响；④富H₂溶液对照后细胞中基因表达的影响。6.富氢溶液对辐射后人正常脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响。实验方法：1.富H₂生理盐水或富H₂培养液的制备：将生理盐水或培养液置入密封袋中，充入足量氢气后加压。富H₂培养液保存于4度冰箱，每周更换一次，保证氢气浓度为0.6mmol/L。2.细胞培养：HIEC细胞、HUVEC细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，加1%双抗，置于含5％CO2的37℃细胞培养箱中。隔天细胞传代。3.细胞及小鼠辐射模型建立：γ射线，1.0Gy/min。4.辐射产生的羟自由基的消除：使用HPF探针，在荧光显微镜下观察荧光强度进行分析。5.辐射后检测细胞生存率：辐射后使用CCK-8试剂盒检测以及辐射后结晶紫染色检测细胞克隆。使用Hoechst/PI荧光染色法检测细胞核形态、细胞存活率以及细胞死亡率。6.细胞凋亡率检测：Annexin V/PI染色后，使用流式细胞仪检测。7.细胞DNA损伤检测：单细胞凝胶电泳分析检测DNA断裂。8.小肠内氢气浓度的检测：小鼠腹腔注射富H₂生理盐水。使用氢浓度检测仪检测不同时间点小鼠体内氢气浓度变化。9.氧化相关指标的测定：使用超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽GSH、丙二醛MDA、羰基化蛋白PC及8羟基脱氧鸟苷8-OHdG试剂盒检测。10.小鼠小肠心脏组织结构的变化：利用HE染色切片观察病理变化。11.小鼠小肠细胞的凋亡检测：使用TUNEL染色试剂盒检测。12.凋亡相关蛋白的检测：Western blot检测γ射线照射后人小肠上皮细胞内凋亡相关蛋白的表达情况。13. γ射线照射后基因表达的影响：Real-time PCR检测γ射线照射后人脐静脉内皮细胞内基因表达情况。14.富氢溶液对辐射后人正常脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响：使用Affymetrix基因芯片检测，使用Real-time PCR方法进行芯片结果验证。15.统计学分析：两组比较，非单组间的比较，采用t检验。多组间比较，采用方差分析。方差分析p<0.05时，进行组间两两比较，使用SNK-P法。P＜0.05时认为各组间差异具有统计学意义。实验结果：1.富H₂培养液预处理减轻辐射后人小肠上皮细胞损伤：经各剂量γ射线辐射后，与照射对照组的HIEC细胞相比富H₂培养液可以显著提高照射后HIEC细胞的存活率和克隆形成率。12Gy1Gy/min γ射线照射后24小时流式细胞仪检测细胞的凋亡率，对照组细胞的凋亡率为50.7%，给予富H₂培养液预处理组细胞的凋亡率为39.3%（P＜0.01）。经过富H₂溶液预处理的HIEC细胞，其彗星尾的长度较照射对照组彗星尾的长度明显减少，对受照HIEC细胞DNA的损伤具有较好的防护作用。以上结果提示富H₂培养液对HIEC细胞具有很好的辐射防护作用。2.富H₂生理盐水预处理减轻辐射后小鼠小肠的损伤：4、8Gy γ射线照后检测小鼠小肠组织中的SOD和GSH含量，富H₂生理盐水组小鼠外周血SOD、GSH活性显著高于照射对照组，同时富H₂生理盐水可显著降低辐射后小鼠小肠组织中的MDA、8-OHdG和PC的浓度。HE染色小鼠小肠组织，Chiu评分统计显示富H₂生理盐水处理可显著减少辐射引起的小肠粘膜损伤。通过TUNEL染色法观察小鼠小肠细胞的凋亡情况，4Gy正常生理盐水组的细胞TUNEL阳性率为46.75%，而富H₂生理盐水组的TUNEL细胞阳性率为24.5%。8Gy正常生理盐水组的细胞TUNEL阳性率为67%，而富H₂生理盐水组的TUNEL阳性率为36%，4Gy组和8Gy组富H₂生理盐水组和正常生理盐水组TUNEL阳性细胞率差异相比具有统计学意义（P＜0.01）。说明富H₂生理盐水能够减轻辐射引起小肠细胞凋亡。3.富H₂培养液预处理减轻辐射后人正常脐静脉内皮细胞的损伤：HUVEC细胞不同剂量照射后，与照射对照组细胞相比富H₂培养液可以显著提高照射后HUVEC细胞的存活率和克隆形成率。4Gy γ线照射后培养24小时，收集细胞后用Annexin V/PI染色，正常培养液对照组的凋亡率为32.2%，富H₂溶液组凋亡率为14.7%，两组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。使用Hoechst33342/PI双染可见，照射对照组HUVEC细胞在照后蓝色荧光增强，亮红色细胞增多，而富H₂培养液预处理后强蓝色荧光和亮红色细胞比照射对照组降低，可以减少HUVEC细胞的凋亡和死亡。4.富H₂生理盐水预处理减轻辐射后小鼠心脏的损伤：给予7Gy照射后，检测小鼠30天生存率，每组小鼠20只，13天时，对照组90%的小鼠死亡，而富H₂组仍有80%的小鼠存活，提示富H₂生理盐水及富H₂水对小鼠有辐射防护作用。6Gy照后4h检测小鼠心脏组织中的SOD和GSH含量，富H₂生理盐水组小鼠心脏中SOD、GSH活性显著高于照射对照组，同时腹腔注射富H₂生理盐水可以显著降低辐射后小鼠心脏组织中的MDA和8-OHdG的浓度。通过HE染色法来观察小鼠心脏辐射后1天及100天的病理变化。1天后，对照组和富H₂生理盐水组均无明显改变，100天后，对照组心肌退化明显，有空泡形成，而富H₂生理盐水组没有明显的病理改变。照射后100天，取小鼠心脏，通过MASSON染色法观察小鼠心肌细胞纤维化的情况，生理盐水对照组MASSON染色阳性细胞率为5%，而富H₂生理盐水组的MASSON阳性细胞率为3.1%。富H₂生理盐水组和生理盐水对照组差异相比具有统计学意义（P＜0.01）。以上结果说明富H₂生理盐水能够减轻辐射引起的心脏损伤和心肌细胞纤维化的形成。5.富H₂溶液辐射防护作用的机制探讨5.1富H₂培养液对辐射产生羟自由基的清除作用：经12Gy射线辐射后，使用HPF染色，荧光显微镜观察荧光强度变化，发现富H₂培养液组中的荧光强度明显低于照射对照组，说明富H₂溶液对辐射产生的羟自由基具有较强的清除作用。5.2富H₂生理盐水对受照小鼠小肠内Caspase3活性的影响：小鼠经6Gy γ射线照后各时间点取小肠组织，检测结果显示各个时间点富H₂溶液组小鼠小肠内caspase3活性较对照组有明显下降（P<0.01）。表明富H₂生理盐水可以减轻辐射所导致的凋亡发生，减轻辐射引起的小肠损伤。5.3富H₂培养液预处理对辐射后人小肠上皮细胞中凋亡相关蛋白的作用：12Gyγ射线辐射24h后，提取HIEC细胞的蛋白进行Western blot检测。结果显示富H₂培养液组中Bcl-2的表达明显上调，Bax的表达显著下调。5.4富H₂溶液对受照人脐静脉内皮细胞内基因表达的影响：HUVEC细胞在经过4Gyγ射线照射4h后，提取RNA，反转录后进行Real-time PCR检测。结果显示，富H₂组中的Bcl-2的产生明显上升，而Bax的产生明显减少。6.基因表达谱检测：分析基因表达谱结果，提示富氢溶液可以调控细胞周期，减少细胞凋亡及死亡，减轻炎症反应，增加细胞抵抗力，提高细胞增值能力，改善机体物质代谢，提高营养利用率，加强生物合成效应，促进细胞因子-细胞因子受体的相互作用。讨论与分析：电离辐射会对机体造成严重的损伤，其对机体产生的作用分为两种，一种为直接作用，造成DNA的断裂，另一种为间接作用，可产生大量的羟自由基，进一步造成组织细胞的脂质过氧化、氧化DNA损伤和蛋白质羰基化，最终导致细胞凋亡和死亡。2007年Ohsawa等人发现，氢气是一种非常理想的抗氧化物质，其具有选择性抗氧化的作用。氢气可以并且只与活性强和毒性强的活性氧反应，比如·OH和ONOO-，而不与可以传递重要信号的活性氧反应。本实验室也在之前的研究中证明了富H₂溶液具有良好的辐射防护作用，我们在对HIEC和HUVEC细胞的实验中发现，富H₂培养液预处理可以增加辐射后上述细胞的存活率，增强细胞的增殖力，减少细胞的凋亡水平。应用富H₂生理盐水预处理后，小鼠的生存率明显提高，并可以提高机体的抗氧化能力，减轻小鼠小肠上皮损伤及小肠上皮细胞凋亡，减少辐射引起的心脏损伤，并且抑制辐射后心肌细胞纤维化的形成。经以上研究，我们发现在使用γ线照射之前应用富H₂溶液，可以有效的清除辐射时产生的羟自由基，防止了脂质过氧化、蛋白过氧化和DNA过氧化，并且可以调控凋亡相关蛋白的表达，最后抑制细胞的死亡与凋亡。在应用基因表达谱检测后，我们进一步发现氢气可以减少细胞凋亡以及程序性死亡，抑制补体级联反应，减轻炎症，增强氨基酸羧酸的转运，加强细胞对低氧环境抵抗力，提高对细胞外刺激的应答，调节细胞周期等。结论：富H₂溶液对人小肠上皮细胞、人脐静脉内皮细胞及小鼠小肠和心脏具有良好的辐射防护作用，其作用机制与有效清除辐射产生的羟自由基及调节凋亡相关蛋白表达有关。通过基因表达谱的检测，氢气辐射防护机制可能与调控细胞周期，减少细胞凋亡及死亡，减轻炎症反应，增加细胞抵抗力，提高细胞增值能力，改善机体物质代谢，提高营养利用率，加强生物合成效应，促进细胞因子-细胞因子受体的相互作用等因素有关。由于富H₂溶液具有副作用小、安全经济等诸多优点，未来富H₂溶液将会成为一种新的辐射防护剂。