色褐链霉菌产磷脂酶D的发酵条件优化及诱变育种研究

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磷脂酶D(PLD)能催化水解磷脂分子中的磷酰氧P-O键生成磷脂酸和羟基化合物,而且当另一种含羟基化合物存在时,磷脂酶D能催化其与磷脂分子末端极性基团发生转磷酯化反应,生成一种新的磷脂。利用磷脂酶D的转磷酯化反应,可制备许多功能良好的稀有磷脂和磷脂衍生物。磷脂酶D广泛存在于各种动植物和微生物(细菌、酵母等)体内,尤其是产自链霉菌的磷脂酶D,表现出较好的水解和转磷酯活性。本文以微生物链霉菌作为生产磷脂酶D的菌种,发酵制备磷脂酶D。首先对色褐链霉菌产磷脂酶D的发酵工艺进行优化,得到其最佳发酵条件;然后利用紫外线、氯化锂及大气压冷等离子体对此菌株进行诱变改良。采用单因素实验,对色褐链霉菌发酵产磷脂酶D的培养条件和培养基组成进行了优化。实验结果表明:摇瓶最佳发酵培养条件为:发酵周期7天,发酵温度28℃,发酵培养基初始pH6.0,接种量3%(v/v),发酵培养基装液量10mL/100mL三角瓶,摇床转速200r/min;通过对发酵培养基组成的优化,确定了最佳氮源为蛋白胨,最佳碳源为可溶性淀粉,其最适添加浓度分别为20.0g/L、25.0g/L,最佳无机盐组合为MgSO4·7H2O 0.5g/L和CaCO3 1.0g/L,最佳表面活性剂为Tween(吐温) 80,最适添加浓度为20.0g/L;其中发酵周期、发酵温度、发酵培养基装液量对发酵产酶影响较大,而且可溶性淀粉、CaCO3以及Tween 80的添加对发酵产酶起到了良好的促进作用。优化后色褐链霉菌发酵产磷脂酶D的酶活比原发酵条件(0.177U/mL)提高了2.2倍,达到0.563U/mL。通过对色褐链霉菌进行诱变选育并得到一株高产磷脂酶D的突变株。首先通过紫外线和氯化锂(LiCl)复合诱变,对色褐链霉菌进行改良,并筛选得到一株名为PU-4的突变菌,然后再对这株菌进行大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变,并筛选得到一株名为PUP-8的高产磷脂酶D菌株,其发酵产酶酶活达到0.878U/mL,比出发菌株酶活(0.562U/mL)提高了56%,且通过传代实验,验证了此菌的遗传稳定性。通过对色褐链霉菌产磷脂酶D的发酵条件优化及诱变育种研究,使得其发酵产酶酶活达到0.878U/mL,比出发菌株发酵条件优化前酶活(0.177U/mL)提高了4倍,取得了良好的效果。
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