在生物的生长发育过程中,有诸多的调控因子参与。其中,多胺（Polyamines,PAs）作为一类小分子物质,能够从多个方面调节生物体的生长发育。多胺存在于所有生物体的细胞中,其氨基上带有的正电荷,可与带负电荷的核酸、磷酸基团、ATP等结合,促进DNA的转录、mRNA的翻译以及蛋白质的翻译后修饰,最终调控生物体的发育过程。多胺是一类含有两个及以上氨基的长链小分子量脂肪胺,主要包括腐胺（Putrescine,Put）、亚精胺（Spermidine,Spd）以及精胺（Spermine,Spm）。生物体可通过自身代谢合成以上三种多胺,其中鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase,ODC）是多胺生物合成过程中的第一限速酶。随着研究人员对多胺的不断深入研究,发现多胺能够参与众多的生理过程,包括诱导自噬、肿瘤抑制、免疫调控、神经及心血管保护等。迄今为止,多胺在哺乳动物中的研究较多,主要集中于亚精胺在肿瘤防治及预防衰老等方面。家蚕是重要的经济昆虫,也是一种变态发育昆虫。其一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段。在整个变态发育过程中,有诸多因素参与其生长发育的调节。然而,多胺是否影响家蚕的生长发育,目前还尚未有报道。基于此,本研究在细胞水平和个体水平上分别探究了多胺在家蚕中发挥的功能。主要研究结果如下:1.多胺通路相关基因的鉴定与表达特征分析多胺的合成与分解由一系列酶参与调控。因此,我们首先在家蚕中鉴定了多胺通路中的 7 个基因,分别是BmODC、BmSAMDC、BmSPDS、BmSPMS、BmSSAT、BmSMO和BmAPAO。接着,我们对其进行组织表达特征和亚细胞定位分析。组织表达特征分析显示,这些基因在家蚕的9个组织中均有表达。其中BmODC与BmAPAO的表达模式类似,且在马氏管中较高量表达。BmSPDS与BmSMO表达模式类似,且在脂肪体中较高量表达。BmSPMS与BmSSAT的表达模式相似,且在精巢中较高量表达。亚细胞定位分析显示多胺通路相关基因特异性地定位于家蚕BmN细胞的不同区域。以上结果暗示多胺通路基因在家蚕细胞和个体组织中发挥着重要的功能。2.外源亚精胺及多胺通路抑制剂调控家蚕细胞的发育为了探究多胺在家蚕细胞中的功能,我们外源添加了亚精胺到BmN细胞中。首先,对亚精胺进行了细胞毒性的检测。结果显示,在0-200 μM的范围内,亚精胺对家蚕BmN细胞均无毒性影响。随后我们选用10 μM亚精胺处理BmN细胞,24 h后通过EdU染色,结果显示亚精胺促进了细胞的增殖活性。同时,细胞周期蛋白相关基因的表达量也显著上调。多胺生物合成过程中有两种限速酶,其中鸟氨酸脱羧酶作为第一限速酶,而S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶作为第二限速酶。α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO）和甲基乙二醛双脒腙（MGBG）分别为鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的抑制剂。为了进一步探究当细胞内多胺含量降低时,是否会影响BmN细胞的增殖活性。我们将DFMO和MGBG以1:1（摩尔比）混合后处理BmN细胞。选用50 μM抑制剂处理细胞24h,检测细胞内腐胺、亚精胺以及精胺的含量均显著性降低。同时,通过EdU染色发现细胞的增殖能力减弱,细胞周期蛋白相关基因显著下调。以上结果表明多胺能够调控家蚕细胞的发育。3.过量表达BmODC基因影响家蚕卵巢发育为了进一步探究多胺在家蚕个体中的功能,我们以多胺生物合成途径的第一限速酶BmODC为靶标构建了过量表达BmODC基因的转基因重组载体piggyBac[3xP3-Red,BmA4P-BmODC]。通过显微注射于D9L家蚕蚕卵中,利用荧光筛选到阳性个体并将其命名为OE-BmODC。通过qRT-PCR技术对5龄第3天的家蚕丝腺、脂肪体、中肠以及性腺中BmODC基因的表达情况进行分析。结果显示,与野生型相比,OE-BmODC转基因家蚕BmODC的表达量显著提高。同时,检测OE-BmODC家蚕中腐胺的含量显著性增加,而亚精胺和精胺的含量无明显差异。这表明我们成功获得了多胺含量提升的转基因家蚕品系。对OE-BmODC转基因品系进行表型观察,发现其输卵管长度明显缩短,成虫产卵量明显减少。接着,我们检测了 OE-BmODC家蚕的卵巢组织中多胺的含量变化,发现其腐胺的含量显著性升高,而精胺和亚精胺的含量无明显变化。这说明转基因家蚕卵巢发育异常可能是由于过量腐胺积累所致。我们进一步检测发现卵黄磷蛋白BmVn在蛋白水平上显著下调表达,且卵巢发育相关基因BmOvo、BmOtu、Bmsxl在转录水平上也下调表达。以上结果表明BmODC基因增量表达后,造成家蚕卵巢内腐胺大量积累,影响了输卵管的发育,最终导致家蚕产卵量减少。4.敲除BmODC导致家蚕胚胎发育异常为了进一步探究当家蚕体内多胺含量降低时,对家蚕发育的影响。我们利用CRISPR/Cas9系统敲除了BmODC基因,成功获得了家蚕敲除品系并将其命名为KO-BmODC。通过对其表型进行观察,发现部分蚕卵能够正常点青、转青,但是有部分突变体家蚕无法正常孵化,最终在胚胎期死亡。我们对突变体品系家蚕胚胎的多胺含量进行检测,发现腐胺、亚精胺的含量均明显降低,精胺的含量无明显变化。基于以上结果,我们推测多胺在家蚕胚胎发育过程中发挥着重要的作用。为了进一步研究多胺影响家蚕胚胎发育的分子机制,我们将敲除BmODC后的蚕卵进行了转录组测序。共筛选到3571个差异表达基因,其中1963个基因上调表达,1608个基因下调表达,并通过qRT-PCR验证了数据的可靠性。对差异基因进行GO功能富集分析显示主要具有核酸结合、蛋白活性、核糖核酸酶活性。KEGG信号通路富集分析显示其主要参与核糖体与氨基酸代谢、细胞生长发育、凋亡等信号通路。我们推测,多胺主要通过调节与生长发育相关基因的转录以及蛋白质的活性从而影响家蚕的胚胎发育。综上所述,本课题从细胞水平和个体水平上分别研究了多胺在家蚕中发挥的重要作用。细胞水平上,探究了亚精胺对细胞增殖和自噬的影响以及多胺生物合成抑制剂对细胞增殖的影响。个体水平上,以多胺合成过程中的第一限速酶BmODC为靶标,通过过量表达和敲除该基因,研究了多胺通路在家蚕卵巢发育和胚胎发育过程中的功能。