新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的对世界养禽业危害极为严重的一种烈性传染病，经过四次世界大流行后，其感染的宿主范围己明显扩大，并且表现出新的生物学特性。过去，．虽然也有报道NDV能自然感染鹅、鸭等水禽，但一般认为水禽对NDV有较强的抵抗力，感染后不易发病和造成流行。然而，自90年代后期，我国陆续有水禽感染NDV强毒并发病的报道，NDV的生物学特性变化及鹅源病毒的来源，已引起了研究者们的重视。Hemagglutinin-neuraninidase（HN)蛋自是病毒表面重要的囊膜糖蛋白之一，它介导了病毒与宿主细胞受体的特异性结合，同时，在促进F蛋白融合与子代病毒释放方面也扮演了重要的角色。因此，进一步研究HN蛋白在病毒致病机制中的作用，将具有非常重要的意义。 基予以上背景，本研究首次以NDV强毒株ZJ1为骨架，通过反向遗传技术将毒力更强的基因Ⅶ型强毒株14和基因II型弱毒株Clone30的HN基因分别替换到该骨架中并拯救出相关重组病毒，再分别以细胞、鸡胚和小鸡为动物模型进行了相关生物学试验以重点阐明HN蛋自与病毒毒力及组织嗜性之闻的关系。 1.相关重组嵌合体病毒的构建及拯救首先，透过PCR定点突变技术，对中闻转移质粒R123实施序列修饰后使HN基因的两端出现单酶切位点AflII和SspI，从而方便HN基因的完整替换。然后，通过PCR扩增出Clone30株和I4株的HN基因，目的片段经AflII和SspI酶切后连入中间转移质粒mRl23中，再经AgeI和FspAI酶切后连入全长质粒pZJI中得到重组质粒pZJl/ClonHN和pZJl/I4HN。圊时pUC/NDV-GFP经AgeI和BstZl7I酶切后将含有GFP的片段插入到重组质粒pZJl/ClonHN和pZJl/I4HN的P和M基因之间后得到了重组质粒pZJl/ClonHN-GFP和pZJl/14HN-GFP。将重组质粒分别和pCI-NP、pCI-P、pCI-L辅助表达质粒共转染BSR-T7/5细胞后，成功拯救出了重组病毒rZJl/ClonHN、rZJl/14HN、rZJl/ClonHN-GFP和rZJl/14HN-GFP。测序结果表明，I4株和Clone30株的HN基因已替换到骨架病毒的基因组中，同时GFP基因也已正确插入到重组病毒的基因组中。 2.HN基因的替换对重组嵌合体病毒生物学特性造成的影响。 2.1重组病毒在细胞模型上的生物学特性差异病毒生长动力曲线、感染细胞后的病变和空斑形态等分析结果显示，I4株和Clone30 株的HN基因在强毒骨架上能很好地发挥其生物学功能，重组病毒rZJl/ClonHN、rZJl/I4HN与骨架病毒rZJl表现出相似的多步生长曲线、一致的细胞病变和空斑形态，只是rZJl/ClonHN的生长速度略微缓慢。 2.2 HN基因的替换对重组病毒毒力的影响通过测定MDT、ICPI、IVPI三大毒力指标，我们分析了HN基因对重组病毒毒力的影响。结果表明，与骨架病毒rZJl相比，rZJl/14HN不影响ICPI的变化，但略微提高了IVPI值和缩小了MDT值；rZJl/ClonHN不影响ICPI和IVPI的变化，但增大了MDT值。 鉴于NDV主要通过消化道和呼吸道感染传播，我们研究了重组病毒在滴鼻、点眼的自然感染途径下对宿主致病性的影响。结果表明，与骨架病毒rZJl相比，rZJl/I4HN能增强对小鸡的致病力；rZJl/ClonHN能降低对小鸡的致病力。2. 3.HN基因的替换对组织感染嗜性的影响前面研究发现，在通过尿囊腔接种和滴鼻、点眼接种时，HN蛋白对病毒的致病性影响更加的明显。为了研究上述差异的原因，我们以GFP标记的重组病毒分别感染鸡胚和小鸡，然后观察荧光在组织中的分布情况。结果发现，与骨架病毒rZJl-GFP相比，rZJl/I4HN-GFP能够广泛地分布到各个组织脏器中；rZJl/ClonHN-GFP分布的组织范围明显缩小，荧光量减少。 通过免疫组化技术分析了重组病毒和骨架病毒的组织嗜性分布情况。结果表明，骨架病毒rZJl在除了肺脏和脾脏外的其它组织均有分布，脑中病毒分布量较少；rZal/I4HN在除了肺脏以外的其它组织中均有分布，并且范围较广，分布量较多；rZal/ClonHN只在气管、肾脏、肝脏中有分布，并且范围较窄、量较少；结论：本研究主要发现为：(1)异源HN蛋白在强毒骨架病毒上仍然能很好地发挥其生物学功能；(2)HN蛋白对病毒的毒力具有一定的影响作用；(3)HN蛋白能够影响病毒的组织感染嗜性，我们推测可能正是这种差异性导致了它对病毒毒力的影响。