论文部分内容阅读
背景视网膜缺血再灌注损伤（Retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI）可激活多种信号通路,激活小胶质细胞、引发炎症反应和促进细胞凋亡等。因此,深入探讨缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）在视网膜疾病中的作用机制及IRI的治疗方案对临床疾病诊疗至关重要。研究发现,在心脏缺血再灌注、脑缺血再灌注等动物模型的组织中,均检测到20-羟二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE）的水平增加,20-HETE可激活核因子κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路、促进炎症因子释放、促进小胶质细胞增殖、上调基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）表达等来造成组织损伤,而注射20-HETE抑制剂N-羟基-N′-（4-正丁基-2-甲基苯基）甲脒（N-Hydroxy-N′-（4-n-butyl-2-methylphenyl）formamidine,HET0016）后,可显著降低20-HETE的水平,从而减轻炎症反应、组织水肿、抑制小胶质细胞活化、下调MMP-9表达等。但20-HETE在RIRI中的表达、及对RIRI的作用机制尚不清楚。目的探讨20-HETE参与大鼠RIRI的病理机制,同时探讨HET0016对RIRI的保护作用,为RIRI的发病机制及治疗提供一定的实验理论依据。方法HET0016相对不溶于水,本实验用15%羟丙基-β-环胡精做为溶剂来增加其溶解性。选择雄性SD大鼠,随机分为正常对照组（CON组）,实验模型组（RIRI组）,实验溶剂组（RIRI+溶剂组）,实验治疗组（RIRI+HET0016组）,其中RIRI组、RIRI+溶剂组、RIRI+HET0016组分为再灌注后24h组、48h组、7d组。在不同时间点处死大鼠,迅速摘除右眼球,剥离视网膜,制作视网膜组织匀浆上清液,ELISA法测定再灌注24h大鼠视网膜中20-HETE及炎症因子TNF-α、IL-1β的水平;眼球固定后做石蜡切片,采用HE染色法观察再灌注24h、48h、7d大鼠视网膜形态及厚度变化,免疫组化法测定再灌注24h大鼠视网膜MMP-9的阳性细胞数及定位表达、再灌注48h视网膜小胶质细胞的活化及定位表达,免疫荧光法观察再灌注24h视网膜细胞p65的核转移情况。通过SPSS25.0对结果进行统计分析。结果1.ELISA法结果显示:RIRI组及RIRI+溶剂组大鼠视网膜中20-HETE及炎症因子TNF-α、IL-1β的水平较CON组增多（P＜0.05）;RIRI组和RIRI+溶剂组两组间20-HETE及炎症因子TNF-α、IL-1β的水平对比无统计学意义（P=0.071,P=0.962,P=0.244）;RIRI+HET0016组大鼠视网膜20-HETE及炎症因子TNF-α、IL-1β的水平较RIRI组及RIRI+溶剂组减少（P＜0.05）,但仍较CON组多（P＜0.05）。2.HE染色结果显示:视网膜形态:CON组视网膜各层形态整齐,结构清晰;再灌注24h、48h,RIRI组及RIRI+溶剂组视网膜结构及形态较CON组紊乱,视网膜各层水肿;再灌注7d,RIRI组、RIRI+溶剂组可见视网膜厚度变薄,RGCs细胞减少;再灌注各时间点,RIRI+HET0016组视网膜病理改变较RIRI组及RIRI+溶剂组减轻。3.免疫组化结果显示:（1）MMP-9:CON组几乎无MMP-9阳性细胞表达;RIRI组及RIRI+溶剂组视网膜可见MMP-9的表达增强,主要位于GCL,与CON组比较有统计学意义（P＜0.05）;RIRI组及RIRI+溶剂组两组间对比无统计学意义（P=0.555）;RIRI+HET0016组MMP-9阳性细胞数较RIRI组及RIRI+溶剂组减少（P＜0.05）,但仍较CON组多（P＜0.05）。（2）小胶质细胞:CON组有少数的小胶质细胞表达;RIRI组及RIRI+溶剂组小胶质细胞表达增多,主要位于GCL、内丛状层,与CON组比较有统计学意义（P＜0.05）;RIRI组及RIRI+溶剂组两组间对比无统计学意义（P=0.713）;RIRI+HET0016组小胶质细胞数较RIRI组及RIRI+溶剂组减少（P＜0.05）,但仍高于CON组（P＜0.05）。4.免疫组织荧光染色:CON组p65主要在胞质中表达;RIRI组及RIRI+溶剂组p65在胞核中表达增多,与CON组比较有统计学意义（P＜0.05）;RIRI+HET0016组p65核转移较RIRI组及RIRI+溶剂组减少,差异有统计学意义（P＜0.05）,但仍高于CON组（P＜0.05）。结论1.大鼠视网膜缺血再灌注24h后20-HETE及炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌量增加、MMP-9表达增多、NF-κB通路p65核转移增加;再灌注48h,小胶质细胞激活、增殖;再灌注24h、48h、7d视网膜形态发生病理改变。2.HET0016干预后,可减少视网膜中20-HETE的分泌量,降低MMP-9的表达、抑制小胶质细胞的活化、抑制p65的核转移及减少TNF-α、IL-1β的分泌量,减轻视网膜的病理改变。3.20-HETE可能通过激活NF-κB通路,增加TNF-α、IL-1β的分泌量,上调MMP-9表达,激活小胶质细胞,加重RIRI。