磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)是一种具有良好的时间和空间分辨率,且不会将患者暴露于辐射环境中的非常安全的成像技术。造影剂是MRI中常用的制剂,它的作用是在外加磁场下,扰乱被检组织周围水分子氢原子核的磁化弛豫过程,包括横向弛豫速率或纵向弛豫速率,从而提高所获取图像的信噪比。造影剂根据增强作用类型可分为阳性造影剂(T1类造影剂)和阴性造影剂(T2类造影剂)两大类。T1类造影剂能使成像部位变亮,应用最广泛的材料是Gd(Ⅲ)类配合物,但是这类配合物在体内的缺点包括:分布无特异性;进入血液后迅速进入细胞间隙;半衰期短;成像部位病变细胞摄取情况不良;游离钆离子对机体毒性较大,以及诱导肾源性系统性纤维化等。T2类造影剂应用于MRI时使得成像部位变暗,这类造影剂一般是铁氧体或超顺磁性氧化铁纳米粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)。裸露的 SPIONs 用于MRI造影剂存在几方面的问题需要解决:①稳定性差,易聚集;②金属或金属氧化物对细胞有毒害作用;③SPIONs进入血液后会造成红细胞损伤,具有血液毒性;④SPIONs进入细胞后会引起细胞内活性氧(re-active oxygen species,ROS)水平升高,对细胞造成损害。表面修饰剂的不但影响纳米材料的生物相容性,而且对生物材料的粘附性有着重要影响。有机/无机表面活性剂/封端剂末端官能团通过静电相互作用或共价键连接到SPIONs的表面原子上能对裸露的SPIONs起到生物改性以及物理性质稳定的作用。曾在全球范围内销售的Feridex,Conbidex和Resovist选用了葡聚糖作为SPIONs的表面修饰剂,并在临床上用做肝脏造影剂多年,但是由于其临床使用中出现诸多副反应,而陆续退市。在诸多副反应中,最常见的是超敏反应,即补体激活相关的假过敏反应(Complement activation-related pseudoallergy,CARPA)。许多含铁药物和造影剂在临床应用方面最大的挑战就是它们可能会引起CARPA,且由于CARPA在造影剂中的普遍性,CARPA已成为造影剂研发中需要关注和解决的问题。糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是一类线性多糖,主要由己糖胺(包括N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基半乳糖胺)和糖醛酸(葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)组成的二糖重复单元构成,其广泛分布在动物细胞表面,细胞内部及细胞外基质中。GAGs根据己糖胺的类型,可分为葡糖胺聚糖和半乳糖胺聚糖,前者有肝素(heparin,Hep)和硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS),后者有硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)和透明质酸(hyaluronic acid,HA)。GAGs 在制药领域有着广泛的应用,例如,肝素类制剂是全球使用最广泛的抗凝剂,用于治疗和预防血栓栓塞性疾病;HA可用作再生医学专用的水凝胶制剂的载体,以及化妆品中的保湿成分;CS可以用作骨关节炎甚至骨质疏松的治疗药物等。GAGs用作纳米材料的表面修饰剂,具有以下性质:高水溶性、无毒、可生物降解、无免疫原性。此外,GAGs富含聚阴离子可以通过静电结合作用稳定裸SPIONs,改善SPIONs易聚集的特性;铁离子作为阳离子会破坏细胞膜磷脂双分子层,造成红细胞溶血,聚阴离子与其结合可以减弱或消除铁离子对细胞膜的破坏或影响;铁基造影剂易通过替代途径激活补体造成CARPA,因子H是替代途径的抑制剂,它具有突出的阴离子结合位点,UFH、CS和HA均为聚阴离子或可以起到抑制补体激活的作用效果。基于以上原因,针对SPIONs作为MRI的T2造影剂使用存在稳定性差以及生物相容性差的问题,本课题拟采用GAGs家族中的分子对SPIONs进行修饰,包括不同分子量的Hep,CS,HA(包括未分级肝素unfractionated heparin,UFH;低分子肝素中的enoxaparin,Eno;高分子量硫酸软骨素high molecular weight chondroitin sulfate,HCS;低分子量硫酸软骨素 low molecular weight chondroitin sulfate,LCS;高分子量透明质酸 high molecular weight hyaluronic acid,HHA;低分子量透明质酸low molecular weight hyaluronic acid,LHA),比较改性后系列SPIONs的稳定性和生物相容性,并将筛选得到的SPIONs修饰物进行肝癌模型小鼠体内MRI成像评价,为研制有效和安全的SPIONs造影剂打下基础。本研究取得的主要结果包括以下几个方面:1 GAGs-SPIONs的制备及表征采用共沉淀法制备SPIONs和GAGs-SPIONs。对其进行了系统表征,包括:1.1采用透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)测量了它们的内核结构,发现SPIONs及GAGs-SPIONs在TEM下均是黑色的球形结构,SPIONs存在明显的聚集现象,与之不同的是,GAGs-SPIONs的分布则较为分散。1.2 采用动态光散射法(Dynamic light scattering,DLS)测量了 GAGs-SPIONs的水动力学直径,发现GAGs-SPIONs的水动力学直径尺寸在100nm左右,且粒径分布均一性高;GAGs-SPIONs的Zeta电位值在-55.4～-23.9之间,表明其胶体分散体系的稳定性高。1.3 采用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FT-IR)检测了 GAGs对SPIONs的修饰情况,发现GAGs-SPIONs的图谱上有相应糖基官能团的特征吸收峰,表明GAGs成功修饰在SPIONs的表面。1.4 采用 X 射线衍射(X-ray diffraction,XRD)测定了 SPIONs 和 GAGs-SPIONs 的晶核结构,发现它们在 18.44°、30.239°、35.521°、43.340°、53.719°、57.141°、62.879°、74.382°处均出现衍射峰,这些衍射峰的位置分别与Fe3O4在(111)、(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)、(533)的晶相相对应,表明SPIONs及GAGs-SPIONs均具有Fe3O4的反式尖晶石结构。1.5 采用变化梯度场磁性测试仪(Alternating Gradient Force Magnetometer,AGM)测量了其磁学性质,发现SPIONs及GAGs-SPIONs均具有一定的磁饱和强度,且在撤除磁场时均不存在磁滞现象和剩磁,表明GAGs-SPIONs与SPIONs一样均具有超顺磁性。1.6采用MRI扫描仪检测了 GAGs-SPIONs的弛豫效能,发现Eno-SPIONs、UFH-SIPIONs、HHA-SPIONs、LHA-SPIONs、LCS-SPIONs、HCS-SPIONs 横向弛豫速率分别为:85.93 mM-1s-1、192.72 mM-1s-1、368.11 mM-1s-1、424.85 mM-1s-1、852.12 mM-1s-1、949.46 mM-1s-1,表明除Eno-SPIONs之外,均具有高于商品化的Feridex和Resovist的横向弛豫速率,显示出用作T2造影剂的潜力。1.7初步稳定性考察。将制备好的GAGs-SPIONs样品存储于4℃环境中进行了初步稳定性考察,发现未经修饰的SPIONs在观察的第2周即出现沉淀,而经过GAGs修饰的SPIONs(GAGs-SPIONs,共六种)在3mon内未见明显变化,初步表明经GAGs修饰,可以显著提高SPIONs的稳定性。2 GAGs-SPIONs的生物相容性评价2.1 GAGs-SPIONs的细胞毒性检测采用CCK-8法检测了 GAGs-SPIONs对小鼠巨噬细胞的存活率的影响。研究发现,铁离子浓度在 3.12～25μg/mL 时UFH-SPIONs、HHA-SPIONs、LHA-SPIONs、LCS-SPIONs、HCS-SPIONs均不会对巨噬细胞产生毒害作用,与之相反,GAGs-SPIONs还表现出十分显著的促进小鼠巨噬细胞存活的作用,而且随着铁离子浓度的增加,巨噬细胞的存活率也随之增加。2.2小鼠巨噬细胞对GAGs-SPIONs摄取能力的检测采用普鲁士蓝染色法检测了小鼠巨噬细胞对GAGs-SPIONs(铁离子浓度在3.12～50μg/mL范围内)的摄取情况。结果发现,随着铁离子浓度的增加,巨噬细胞内GAGs-SPIONs的富集也越来越多。当铁离子浓度为25μg/mL时,UFH-SPIONs、LCS-SPIONs和LHA-SPIONs组小鼠巨噬细胞内蓝色斑点数量趋于饱和;当铁离子浓度为12.5μg/mL时,HCS-SPIONs组小鼠巨噬细胞内蓝色斑点数量趋于饱和;当铁离子浓度为50μg/mL时,HHA-SPIONs组小鼠巨噬细胞内蓝色斑点数量趋于饱和。这表明小鼠腹腔巨噬细胞对GAGs-SPIONs有着良好的摄取能力,这是它们用作MRI造影剂的基础。2.3 GAGs-SPIONs的溶血性能检测溶血试验检测发现,UFH-SPIONs,LCS-SPIONs和LHA-SPIONs在铁离子浓度为10～25μg/mL范围内的溶血率均在可接受的范围内,血液相容性良好;而HCS-SPIONs和HHA-SPIONs出现溶血率大于5%的情况,血液毒性较大。2.4 GAGs-SPIONs的补体激活体外检测采用 ELISA 法检测了 GAGs-SPIONs 中 LHA-SPIONs,UFH-SPIONs 和 LCS-SPIONs与人血清相互作用后血样中人补体复合物SC5b-9,补体因子BFactor(BF)的含量。结果发现,3者均无引起明显的补体激活反应(P>0.05)。2.5 GAGs-SPIONs对巨噬细胞ROS水平影响的检测采用活性氧检测试剂盒考察了 LHA-SPIONs,UFH-SPIONs和LCS-SPIONs在铁离子浓度为50μg/mL和100μg/mL时对小鼠腹腔巨噬细胞内ROS水平的影响。结果发现,较阴性对照组,各GAGs-SPIONs都没有引起巨噬细胞内ROS水平的显著增高(P>0.05)。其中,两个浓度下UFH-SPIONs组与阴性对照组相比,还均能够显著降低细胞内ROS水平(P<0.01);铁离子浓度为100μg/mL时,LHA-SPIONs也能显著降低细胞内ROS水平(P<0.01)。2.6 UFH-SPIONs对小鼠凝血系统的影响采用小鼠断尾法考察了优选出来的造影剂UFH-SPIONs对小鼠凝血系统的影响。以生理盐水作为阴性对照药,以肝素为阳性对照药,Feridex的人体推荐剂量作为参考,分别给予实验组1每只小鼠尾静脉注射铁离子质量为125μg的UFH-SPIONs,实验组2每只小鼠尾静脉注射铁离子质量为125μg的UFH-SPIONs至小鼠体内。结果发现,阴性对照组出血时间在300s左右,阳性对照组(肝素组)的出血时间为1800s,对结果的统计分析表明,UFH-SPIONs对小鼠的凝血系统没有显著影响(于阴性对照组相比P>0.05),提示将来用于体内应用不会发生由肝素引发的出血现象。3 GAGs-SPIONs在小鼠体内组织分布研究单次尾静脉LHA-SPIONs,UFH-SPIONs和LCS-SPIONs(铁离子浓度为5mg/kg体重)后,用组织铁测定试剂盒检测各组织标本中铁元素的含量,以考察各GAGs-SPIONs在小鼠血浆、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织的分布。研究发现,UFH-SPIONs,LCS-SPIONs和LHA-SPIONs在小鼠血浆中的半衰期分别为0.3h,0.24h和0.46h,与文献报道的SPIONs的血浆半衰期相比具有延长SPIONs血浆半衰期的作用;GAGs-SPIONs在富含巨噬细胞的组织(肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织)中有明显的分布,表明GAGs-SPIONs有用于上述组织MRI成像提高显影效率的潜力。4 GAGs-SPIONs在小鼠肝癌模型中MRI成像情况检测复制裸鼠肝癌模型,通过尾静脉给药的方式,给予每只小鼠5mg/kg铁离子浓度的 GAGs-SPIONs(包括 LCS-SPIONs、UFH-SPIONs、LHA-SPIONs),使用磁共振扫描仪采集给药前及给药后15、30、60、90、120min的T2加权MRI图像;并收集每张图像的信噪参数,绘制给药后图像信噪比随时间变化的图像。结果发现,肝癌模型裸鼠给药后,在1小时内造影效果较为显著,其中在60min前后达到最佳造影效果;MRI图像信噪比改变率结果表现出先上升后下降的变化过程,且在给药后 60minutes 时,LCS-SPIONs、UFH-SPIONs、LHA-SPIONs 裸鼠图像的信噪比增加幅度均达到最大值,较给药前分别增加了 50.68%、67.22%、71.75%。结果表明,LCS-SPIONs、UFH-SPIONs、LHA-SPIONs 均有良好的提升MRI图像对比度的能力。总之,本课题利用GAGs对SPIONs修饰可以有效改善裸SPIONs应用中稳定性差、生物相容性差(细胞毒性、溶血、CARPA反应、ROS释放)及体内半衰期短等问题,而且制备得到的GAGs-SPIONs保留了 SPIONs的超顺磁特性;并经体内分布和荷瘤小鼠MRI成像效果评价,认为LHA-SPIONs,UFH-SPIONs和LCS-SPIONs是有效且安全的MRI T2造影剂,有望用于肝脏等富含巨噬细胞脏器组织的MRI检测中。