第一部分应用基因芯片技术对肝细胞肝癌、肝硬化和正常肝组织中差异表达基因的检测目的:应用基因芯片技术,分别检测肝细胞肝癌与正常肝组织之间及肝硬化与正常肝组织之间基因表达谱的差异,对差异表达的基因进行分类汇总,并分析他们的生物学信息,为肝癌的诊断治疗提供帮助。方法1研究对象:河北医科大学第四医院肝胆外科手术切除,并经病理学检查证实的,单发无转移的肝细胞癌病人癌组织4例,肝硬化病人硬化肝组织1例,肝血管瘤周边正常肝组织1例。所有患者术前均未进行任何形式的治疗。2研究方法:组织手术切除后,迅速放入液氮中冷冻,之后转入-80℃冰箱备用。用Trizol一步法分别提取肝癌癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA,逆转录合成荧光分子(Cy3/cy5)标记的cDNA探针,与含有4096个基因的人表达谱芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析硬化肝组织与正常肝组织,肝细胞癌组织与正常肝组织的基因表达情况。将结果进行汇总,并在网上基因库查询相关基因生物学信息。结果1肝细胞癌组织与正常肝组织之间及肝硬化组织和正常肝组织之间的基因表达谱差异明显。2在癌组织中表达情况一致并且与正常肝组织比较有差异的基因有141条,占基因总数的3.5%,其中上调的有51条,下调的有90条。上调的基因功能多数与细胞增殖及细胞信号转导有关,其中包含许多新近发现的与肿瘤关系密切的基因,如MCM7、14-3-3η及GRB2等。下调的基因功能多数与物质代谢有关;在4例肝癌组织和1例肝硬化组织中表达情况一致并与正常肝组织表达情况相比较有差别的基因有23条,占基因总数的0.6%,其中上调的有7条,下调的有16条。基因功能多数与细胞增殖和胶原形成有关,如PCNA、SPARC及COL3A1等。在癌组织和硬化肝组织中表达情况相反并且与正常肝组织比较有差异的基因有2条,均属于金属硫蛋白基因家族成员。另外,尚有一些目前功能未明的基因有待于进一步研究。结论:使用基因芯片技术可以一次性、平行的比较不同组织的表达谱差异,因此,这种技术能够对肿瘤研究提供很大的帮助。借助这一技术,本研究发现了大量与原发性肝细胞肝癌形成有关的基因群,其中,许多基因都与细胞周期的调控和信号转导有关,另外尚有部分功能未明的基因。对这些基因进行系统的研究将有助于阐明肝癌的发生机制、发现新的早期诊断指标、指导治疗方案和预后评估。第二部分部分差异表达基因的半定量RT-PCR检测目的:从芯片结果中选取部分在不同病变肝组织中表达有差异的基因,同时增大各组样本的例数,用半定量RT-PCR技术来比较这些基因在肝细胞肝癌、癌旁硬化肝组织及正常肝组织中的表达情况,来验证芯片结果的可靠性,并初步探讨这些基因与肝细胞肝癌之间的关系。方法1研究对象:河北医科大学第四医院肝胆外科手术切除,并经病理学检查证实的19例肝细胞肝癌病人癌组织,11例癌旁硬化肝组织及7例肝血管瘤周边正常肝组织。所有患者术前均未进行任何形式的治疗。从芯片结果中选取在各组中表达有差异的基因:MT3、14-3-3蛋白基因家族成员14-3-3γ和14-3-3η、MCM7及RBL2/P130,行半定量RT-PCR来检测它们在上述组织中的表达情况。2研究方法:分别提取肝癌癌组织、癌旁硬化肝组织及正常肝组织的总RNA,逆转录合成cDNA,加入相应的引物进行扩增,同时以β-ACTIN作为内参照,比较上述基因在各组中的表达情况。将这些基因的表达情况与肝细胞癌患者的临床表现相结合,初步探讨这些基因与肝细胞肝癌之间的关系。结果1肝癌组织中MT3基因的表达显著低于癌旁硬化肝组织和正常肝组织(分别为p<0.01、p<0.05)。肝癌组织中肿瘤分化程度越低,MT3基因的表达水平越低。MT3在癌旁硬化肝组织中的表达水平虽然高于正常肝组织,但无统计学意义。2肝癌组织中14-3-3γ基因的表达显著低于癌旁硬化肝组织和正常肝组织(p<0.01)、14-3-3η基因的表达显著高于癌旁硬化肝组织及正常肝组织(p<0.05)。3肝癌组织中MCM7基因的表达显著高于癌旁硬化肝组织和正常肝组织(p<0.05),RBL2/P130基因的表达显著低于癌旁硬化组织和正常肝组织(分别为p<0.01)。肝癌组织中肿瘤的分化程度越低,MCM7基因的表达水平越高,RBL2/P130基因的表达水平越低,并且MCM7基因的表达水平与RBL2/P130基因的表达水平呈负相关(r=-0.649,p=0.003)。结论1 MT3基因与肝细胞肝癌的形成关系密切,其表达水平能够反映肝癌的恶性程度。2 14-3-3基因家族调控网络的失调在肝癌的形成过程中发挥了一定的作用。其作用机理有待于进一步研究。3 MCM7基因在肝癌组织中的表达水平显著升高,并与肝癌的分化程度成负相关,有望作为肿瘤增殖标志物。RBL2/P130抑癌基因的失活推动了肝癌的发生。4肝癌的发生、发展是个复杂的病理过程,其间有大量的基因发生了改变,这些基因之间又可能存在着千丝万缕的联系,对这些基因进行系统的研究将有助于肝癌的诊断和防治。5在扩大样本例数以后,半定量RT-PCR的研究结果与芯片研究结果基本一致,提示基因芯片是一种可行的研究技术,其研究结果具备一定的可重复性。第三部分MCM7蛋白、RBL2/P130蛋白及Cyclin D1蛋白在肝细胞肝癌中的表达情况及临床意义目的:研究MCM7蛋白及RBL2/P130蛋白、Cyclin D1蛋白在肝癌中的表达情况,探讨各蛋白间相互关系及临床意义。方法1研究对象:44例肝细胞癌组织、26例癌旁硬化肝组织及18例肝血管瘤周边正常肝组织(作为对照)均来自河北医科大学第四医院肝胆外科手术切除标本。所有组织类型均经河北医科大学第四医院病理科确诊。所有患者术前均未进行任何形式的治疗。2研究方法:组织切除后经10%中性甲醛固定后石蜡包埋备用。应用免疫组织化学法检测MCM7蛋白及RBL2/P130蛋白、Cyclin D1蛋白在不同肝组织中的表达情况。对肝癌患者的临床资料进行汇总,探讨各蛋白间的相互关系及与肝细胞肝癌患者临床表现间的关系。结果1 MCM7蛋白在各组中的表达情况MCM7蛋白在肝癌组织中的阳性表达率是72.7%,表现为细胞核黄染。MCM7蛋白在癌旁硬化肝组织和正常肝组织中无表达。MCM7蛋白在肝癌组织中的表达与患者年龄、性别、有无癌栓、癌灶个数及乙肝阳性与否无关;MCM7蛋白在直径≥5cm的癌组织中的阳性率显著高于其在瘤体直径<5cm的癌组织中的阳性率(χ2=6.57,P<0.05);MCM7蛋白在无包膜的癌组织中的阳性率为100%。在包膜不全的癌组织中的阳性率为88.2%,显著高于在包膜完整的癌组织中的阳性率52.4%(χ2=5.59,P<0.05);肝癌分期越高,MCM7蛋白的阳性率越高。III期癌组织中的阳性率94.1%显著高于I期的54.5%(χ2=6.21,P<0.05),和II期的62.5%(χ2=4.93,P<0.05);MCM7蛋白在AFP≥400ug/L的癌组织中的阳性率显著高于AFP<400ug/L的癌组织中的阳性率(χ2=6.38,P<0.05);肝癌的病理分级越高,癌组织中MCM7蛋白的阳性表达率越高,III级及IV级癌组织中的阳性率为90%,显著高于其在I级及II级癌组织中的阳性率58.3%(χ2=5.52,P<0.05)。2 RBL2/P130蛋白在各组中的表达情况RBL2/P130蛋白在各组肝组织中均有表达。RBL2/P130在肝癌组织中的表达阳性率为34.1%,在癌旁硬化肝组织中的阳性表达率为69.2%,在正常肝组织中的阳性表达率为72.2%,表现为细胞核和(或)细胞浆黄染;其在肝癌中的表达率显著低于癌旁硬化肝组织和正常肝组织(χ2=8.09或χ2=7.5, P<0.01)。3 Cyclin D1蛋白在各组中的表达情况Cyclin D1蛋白在各组肝组织中均有表达。Cyclin D1蛋白在肝癌组织中的表达阳性率为68.2%,在癌旁硬化肝组织中的阳性表达率为34.6%,在正常肝组织中的阳性表达率为27.8%,表现为细胞核和(或)细胞浆黄染;其在肝癌中的表达率显著高于癌旁硬化肝组织和正常肝组织(χ2=7.46或χ2=8.48, P<0.01)。4肝癌组织中MCM7蛋白与RBL2/P130蛋白、Cyclin D1蛋白表达情况的相关性肝癌组织中MCM7蛋白与Cyclin D1蛋白的表达呈正相关(r=0.568, P<0.01),与RBL2/P130蛋白的表达呈负相关(r=-0.636, P<0.01);Cyclin D1蛋白与RBL2/P130蛋白的表达呈负相关(r=-0.538, P<0.01)。结论1 MCM7的表达水平能够很好的反应肝癌细胞的增殖能力、肝癌细胞的恶性程度及肝癌的发展阶段,监测其在肝组织中的表达情况能对肝癌的早期诊断、预测肿瘤复发及评价预后提供很大的帮助。2 Cyclin D1表达水平的提高在肝癌的发生、发展过程中发挥促进的作用。RBL2/P130对肿瘤的发生具有抑制作用,其表达水平的降低间接促进了肝癌的形成。3 Cyclin D1/CDK4-RBL2/P130-MCM7调控路径的活化在肝癌的形成过程中发挥了重要的作用。针对性的抑制Cyclin D1/CDK4-RBL2/P130- MCM7调控路径的活化可能对肝癌的治疗提供一定的帮助。