抗食源性致病菌的益生菌生物活性膜制备及性能研究

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致病菌引发的食源性疾病或食物中毒对公共健康造成了重大威胁,食源性致病菌的污染是全世界食品安全面临的首要问题。基于减少使用化学防腐剂及人工添加剂的需求,以益生菌拮抗作用为代表的生物防控食源性致病菌策略显示出很大的优势。益生菌可通过自身拮抗作用或其活性代谢产物控制食源性致病菌的生长和繁殖,将益生菌添加到适宜其生长代谢的高分子基质中制备的生物活性材料在食品包装工业中具有广泛的应用前景。本研究筛选出对食源性致病菌具有较高抗菌活性的益生菌,并添加到适宜的高分子材料中以制备出益生菌生物活性膜,对益生菌膜进行优化并对其理化性能进行了表征,对益生菌膜的抑菌作用及益生菌的存活情况进行了评价,分析了益生菌的抑菌代谢产物及益生菌的代谢特性和潜在抑菌机理,对益生菌生物活性膜进行了安全性评价并对其在实际应用中的抑菌及保鲜作用进行了评价。本文主要的研究内容和结果如下:(1)通过交叉划线法、径向划线法、琼脂扩散法及液体共培养法评价益生菌对食源性致病菌的抗菌活性,并筛选出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌及鼠伤寒沙门氏菌四株代表性食源性致病菌具有最高抗菌活性的益生菌菌株。结果表明,大多数的益生菌对革兰氏阳性菌具有不同程度的抑制作用,而对革兰氏阴性菌没有明显的抑制作用;益生菌培养液的抗菌效果是最好的,不同菌株上清液和菌悬液的抑菌效果不同,副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei CICC 20241对四株食源性致病菌具有较高的抗菌活性,其培养液、上清液和菌悬液均具有较好的抑菌效果;在先接种益生菌后接种致病菌的液体共培养中,L.paracasei CICC 20241显示出最高的生长活性和拮抗活性。(2)将筛选的益生菌添加到适宜其生长且具备较好机械性能的高分子材料以制备益生菌生物活性膜,并结合模糊综合评判和响应面优化设计确定构成膜材料各组分的最佳配比,对益生菌生物活性膜的机械性能、光学性能及阻隔性能等理化特性进行评价,并通过扫描电子显微镜、原子力显微镜、傅里叶红外光谱、X射线衍射等对其进行表征。结果表明,经方差分析和显著性检验,建立的回归模型拟合度高,能够较好地反应真实的响应面,可用以预测最佳的因素参数,当羟丙基纤维素、魔芋精粉、丙三醇含量为0.586%、0.858%、1.620%时,可获得最大的预测综合响应值;优化的益生菌生物活性膜具有较好的拉伸特性和穿刺特性,具有较高的光泽度和可接受的色值,并具备一定的阻水性能和阻氧性能;扫描电子显微镜和原子力显微镜表征了益生菌膜的微观形态,显示益生菌已成功包裹到膜中,益生菌膜具备良好的结构完整性;傅立叶红外光谱及X射线衍射显示益生菌膜的各组分存在较强的分子间相互作用,促进结晶性质的变化并呈现出良好的相容性。(3)评价益生菌生物活性膜对四株代表性食源性致病菌的抑制作用,测定益生菌在膜中的存活情况,通过气相色谱质谱联用和液相色谱质谱联用解析益生菌生物活性膜中的抗菌代谢产物,并揭示益生菌的代谢特性及抑菌作用机理。结果表明,在模拟冷藏条件下的储藏期间内,益生菌生物活性膜对四株食源性致病菌具有较好的抑制效果,该膜是适宜益生菌存活的生态环境,膜中益生菌与致病菌间存在相互作用,将具有抑菌作用的益生菌包埋于膜中制备益生菌生物活性膜是一种可行的保持益生菌存活率及控制食源性致病菌的有效方法;益生菌生物活性膜中的抑菌物质为一类非蛋白质类的、分子量小于1 k Da的、极性相对较大的物质;气相色谱质谱联用鉴定了膜中益生菌产生的挥发性代谢产物;液相色谱质谱联用对膜中益生菌的代谢特性进行分析,膜中益生菌产生的代谢物质的种类及数量均随贮藏时间的变化而显著变化,益生菌产生的多种广谱抑菌活性的小分子化合物通过协同效应增强了抑菌活性并扩大了应用潜能。(4)对益生菌生物活性膜进行了系统性的体外细胞毒性及体内动物毒性评价。结果表明,各浓度益生菌膜处理的人肝癌细胞Hep G2、人胃癌细胞BGC-823及人结肠癌细胞Caco-2均能正常生长,细胞的显微形态均无异常,细胞的相对存活率均在95%以上,益生菌膜在细胞毒性安全方面是合格的;各浓度益生菌膜对小鼠的一般体征及体重增长均无明显不良影响,各浓度益生菌膜处理组小鼠的血液生化指标与对照组指标的差异属于正常范围,各浓度益生菌膜处理组小鼠的脏器形态、脏器指数及组织切片与对照组相比均无明显差异。(5)研究益生菌生物活性膜对草莓表面原始菌群及接种致病菌的抑制作用,通过测定与果实生理生化过程相关的各种理化指标评价益生菌膜对草莓的保鲜作用。结果表明,益生菌膜对草莓表面的原始菌群和接种的致病菌具有良好的抗菌效果,能在储存期间内有效抑制原始的总嗜冷菌、肠杆菌、假单胞菌、酵母和霉菌以及接种的食源性致病菌的生长;益生菌膜能有效降低草莓的呼吸强度及重量损失,维持果实的正常代谢及硬度性状,减缓果实中酸类、糖类、可溶性固形物等的消耗,抑制草莓中多酚氧化酶、过氧化物酶的活性及过氧化氢酶活性的降低,延缓果实中酚类、黄酮类的降解,减缓色值的下降;益生菌生物活性膜能够较好地抑制有害微生物对果实造成的损害,进而有效地保持草莓的营养物质以及良好的外观品质,延缓果实的成熟衰老,进而延长货架期。
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